目标捕获测序技术确诊新生儿阿姆斯特丹侏儒症一例中华医学会围产医学分会

本文引用格式：高敏，张琼琼，李晓梅，等.目标捕获测序技术确诊新生儿阿姆斯特丹侏儒症一例[J] . 中华围产医学杂志, 2017,20(2):93-95. DOI：10.3760/cma.j.issn.1007-9408.2017.02.004

患儿女性，10 d，因“发育异常，吃奶差10 d”于2015年9月28日入院。患儿为双胎之大（双胎之小未患病），出生胎龄37周，剖宫产出生，无窒息抢救病史，生后即有吃奶差及反应差等表现。其母亲28岁，否认妊娠期高血压、糖尿病、心脏病、肾病及感染性疾病等病史。早、中和晚孕期定期行胎儿B超检查，两胎儿胎龄评估基本一致，预测体重较同胎龄正常双胎儿偏低。该例患儿入院时体格检查：体重2 040 g，头围31 cm，身长40 cm；体温36.6℃，呼吸52次/min，心率140次/min，血压65/40 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）；未吸氧，动态监测经皮血氧饱和度95%~100%。患儿可见特殊外貌，包括眉毛浓密，睫毛长，鼻头小而上翘，上唇薄，腭弓高，口紧闭（图1A）；后发际低，背部毛发浓密（图1B），上肢末端细小（图1C），肌张力增高，四肢不能伸直。心脏听诊可闻及4/6级收缩期杂音。余未见明显异常。超声心动图示动脉导管未闭（0.22 cm）、卵圆孔未闭。头颅MRI示双侧大脑半球髓质呈稍长T1和稍长T2信号。血常规、C-反应蛋白、降钙素原、肝肾功能及肌酸激酶同工酶等未见明显异常。血培养未见细菌生长。染色体核型分析正常。入院后给予酪酸杆菌、布洛芬及静脉营养等治疗，5 d后家长要求出院。对患儿进行随访，患儿因喂养困难，于1月龄时死亡。

经本院伦理委员会批准，并取得患儿家长知情同意后，抽取患儿及父母外周静脉血3 ml，乙二胺四乙酸抗凝，采用天根生化科技（北京）有限公司生产的天根血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA。采用目标序列捕获测序技术，对与阿姆斯特丹相关的靶基因（NIPBL，SMC1A，SMC3，RAD21，HDAC8）序列进行捕获测序。根据目标序列捕获测序的结果设计引物（表1），并将患儿及其父母的样本分别进行目标序列的聚合酶链反应扩增及Sanger测序，扩增采用为常规通用程序。

将测序结果与目标序列捕获测序的结果进行比较。测序数据运用NextGene V2.3.4软件，与University of California Santa Cruz（UCSC）数据库提供的人类基因组hg19参考序列进行比对。基因测序结果显示，患儿外周血中发现NIPBL（Nipped-B-Like）基因第42外显子存在c.7150C>T (p.Q2384X)杂合突变，而患儿的父母（表型正常）及正常人数据库中未发生此突变，患儿NIPBL基因c.7150C>T突变为新生突变（图2），该密码子由CAA变为终止密码子TAA，造成氨基酸链合成终止。

讨论

阿姆斯特丹侏儒症又称德朗热综合征（Cornelia de Lange Syndrome，CdLS），是一种多发性先天异常综合征，在新生儿中的发病率约为1/10 000[1]。本病是一种多发性先天异常综合征，其主要特征是显著的宫内生长发育迟缓，具有典型的面部特征，如短头或小头畸形，面、额及背部多毛发，浓眉，“一”字眉，上唇薄及唇角下斜等，并可能出现多发畸形，尤以上肢畸形多见。该病患儿常有严重的生长发育落后和智力低下，存活者常因生长发育落后、肠梗阻、感染或突发心脏疾病等合并症而死亡。阿姆斯特丹侏儒症的遗传方式可分为常染色体显性遗传和X连锁遗传。根据致病基因不同，可将本病分为5个亚型，分别是与NIPBL（5p13.2）相关的CdLS1[在线人类孟德尔遗传（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）：122470]、与SMC1A（Xp11.22-p11.21）相关的CdLS2（OMIM：300590）、与SMC3（10q25.2）相关的CdLS3（OMIM：610759）、与RAD21（8q24.11）相关的CdLS4（OMIM：614701），以及与DAC8（Xq13.1）相关的CdLS5（OMIM：300882）。

NIPBL基因位于染色体5p13.2，长度为189 kb，有48个外显子。NIPBL是黏连蛋白环的装载因子，与黏连蛋白环和染色体的特异性结合、DNA的损伤修复和基因的转录调控等有关[2-4]。人类NIPBL基因突变与阿姆斯特丹侏儒症发病相关，80%的阿姆斯特丹侏儒症患者具有NIPBL基因突变[5]。与携带其他基因突变的阿姆斯特丹侏儒症患者相比，NIPBL基因突变引起的阿姆斯特丹侏儒症表型更严重[6]。与错义突变相比，NIPBL基因的无义突变、剪切位点突变和移码突变多引起更严重的认知和结构缺陷表型。

本研究采用目标捕获测序技术对患儿测序。首先构建DNA文库，通过探针捕获与阿姆斯特丹侏儒症相关的靶基因序列，并针对可疑致病位点，对患儿及其父母行Sanger测序验证，结果发现，本例患儿为NIPBL基因c.7150C>T (p.Q2384X)突变，为尚未报道的新突变。该突变位于NIPBL基因的第42号外显子上，使密码子由CAA变为终止密码子TAA，蛋白编码提前终止。该突变使该外显子编码的蛋白（多肽）长度由67个氨基酸，缩短至27个，造成蛋白结构不完整，进而影响蛋白功能。NIPBL基因第42号外显子上的c.7102C>T、c.7106delA、c.7168G>A和c.7198delC等突变[6-9]均可导致阿姆斯特丹侏儒症的发生，其中，c.7102C>T p.(Gln2368Ter)为无义突变，造成第42号外显子编码的蛋白提前终止。位于NIPBL基因的其他外显子上的无义突变，如c.2422C>T、c.2146C>T、c.6880C>T、c.8377C>T和c.7178C>G等也被报道与阿姆斯特丹侏儒症相关[10-12]。目前，关于NIPBL基因已报道了300多个突变，但该基因的c.7150C>T (p.Q2384X)突变未见报道。本例患儿毛发浓密，后发际低，睫毛长，鼻头小而上翘，上唇薄，腭弓高，口紧闭，极少张口啼哭，四肢末端细小，肌张力增高，四肢不能伸直，身体结构缺陷严重，与报道相符[7,13-15]。

本例患儿为10日龄，有阿姆斯特丹侏儒症的临床表现，但不能明确其疾病亚型。本研究利用目标捕获测序不仅明确了对阿姆斯特丹侏儒症的基因诊断及分型，而且发现了该患儿存在的NIPBL基因c.7150C>T杂合突变。目标捕获测序技术根据反应信号实时阅读，可检测高达400万条序列，读取1G~14G碱基数，根据特定位点的变异，通过Sanger测序验证，进一步确保突变检测的准确性，不仅可以明确不同类型阿姆斯特丹侏儒症的基因诊断，还利于发现新的位点突变，丰富本病的遗传数据库。

参考文献

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