子痫前期(preeclampsia，PE)是一种常见且严重的妊娠并发症，全世界发病率为3%～10%，每年造成超过50 000名孕产妇死亡^[1]。以34周为界限，PE可分为早发型子痫前期(early-onset preeclampsia，EOPE)和晚发型子痫前期(late-onset preeclampsia，LOPE)^[2]。虽然EOPE的发生率不如LOPE高，但EOPE与新生儿和孕产妇死亡率增加有关^[3]。因此，越来越多的医生关注EOPE，并致力于探索这种疾病表型背后的机制，这也促进了EOPE预测生物标志物的开发^[4]。

铁死亡是最近发现的一种铁依赖性细胞死亡类型^[5]。铁死亡和其他不同类型的细胞死亡(如细胞凋亡、坏死性凋亡、自噬、铜细胞凋亡、细胞焦亡、净细胞死亡和嵌顿)形成一系列程序性细胞死亡，尤其在肿瘤的发生发展中起着非常重要的作用^[6]。随着研究方法和技术的不断创新，越来越多的证据证实它在PE中起着至关重要的作用。但关于PE铁死亡的研究较少，铁死亡是否在PE中发挥作用尚不明确。Beharier等^[7]将铁死亡与胎盘生理学和滋养细胞损伤联系起来，包括胎盘发育过程中的缺氧再灌注、丰富的滋养细胞铁以及PE病理生理学中脂毒性的证据。此外，胎盘损伤过程中谷胱甘肽过氧化能力和脂质过氧化修复能力降低，小鼠实验验证了谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)保护胎盘滋养细胞免受铁死亡损伤的作用。在PE的研究中发现，蛋白质去糖酶DJ-1通过调控Nrf2/GPX4信号通路介导滋养层细胞铁死亡发挥重要作用^[8]。Ding等^[9]应用生物信息学研究证实，SRXN1和NQO1可能是PE发病机制中关键的铁死亡相关蛋白。

近年来，EOPE患者外周血的研究越来越受到重视。Moufarrej等^[10]提出了早期识别PE进展的新假说，通过液体活检技术对妊娠5～16周孕妇的18个基因进行测量，成功构建预测模型，可识别EOPE在临床症状出现之前的风险。Rasmussen等^[1]分析了来自8个独立前瞻性收集的队列的综合转录组数据，揭示了血清无细胞RNA可以强有力地预测PE，并认为PE的血清无细胞RNA特征独立于临床因素。

因此，越来越多的研究证实，铁死亡在PE的发生中起着非常重要的作用。本研究旨在寻找EOPE患者外周血中差异表达的铁死亡相关基因，从而构建EOPE的预测模型，以期为其治疗寻找分子靶点。

从基因表达综合(gene expression omnibus，GEO)数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载了66例PE组和240例正常对照组(GSE149440)的基因表达和临床信息。使用Sangerbox在线分析工具进行数据标准化和转换。GSE149440芯片分组见CEO数据库。铁死亡相关基因来自FerrDb数据库(http：//www.zhounan.org/ferrdb)，共获得258个铁死亡相关基因。

使用线性模型微阵列数据(linear models for microarray data，LIMMA)分析软件获得EOPE和正常对照样品中差异表达基因的表达谱。LIMMA是一种基于广义线性模型的差异表达基因筛选方法，本研究使用R语言软件包limma(3.40.6版本)进行差异分析，获得差异表达基因。如果log2(fold change) > 1且FDR<0.05，则被定义差异表达的基因。差异表达基因的火山图和热图使用Sangerbox在线工具的软件制作(http：//vip.sangerbox.com/)。P<0.05和FDR<0.25为差异有统计学意义。

使用基因属性(gene ontology，GO)功能注释和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)在线分析工具获得铁死亡相关基因的GO功能注释和KEGG信号通路。

本研究使用R语言软件包glmnet整合生存时间、生存状态和37个铁死亡相关基因表达数据，建立最小绝对收缩和选择算子(least absolute shrinkage and selection operato，LASSO)回归模型。

使用两个在线网站Metascape[11](https：//metascape.org/gp/index)和String (https：//string-db.org/)预测15个铁死亡相关基因的蛋白质-蛋白质相互作用网络。

通过对GEO数据库中66例PE组和240例正常对照组的基因表达谱进行分析，利用LIMMA分析软件，得到各基因的差异显著性，最终共计2774个表达上调和1237个表达下调的差异表达基因(共4011个差异表达基因)，提示PE患者血清中基因的表达差异较大，可能与PE的发生发展有相关性。差异表达基因火山图见图1A；图1B为PE组66例和对照组240例正常对照组前20个差异表达基因的表达热图。

对4011个差异表达基因进行功能富集分析，KEGG分析表明这些基因参与了很多的信号通路，其中包括铁死亡信号通路(图2A)。

遂进一步将4011个差异表达基因与258个铁死亡相关基因取交集，过滤得到37个差异表达的铁死亡相关基因，用于后续研究，结果如图2B的韦恩图所示。

对37个差异表达的铁死亡相关基因进行功能富集分析，GO功能分析表明其参与了应激反应、程序性细胞死亡、羧基代谢过程、细胞凋亡和饥饿反应等12个生物学过程(图2C)。

KEGG分析表明，这些基因参与自噬、谷胱甘肽代谢、利什曼病、程序性死亡-配体1表达和癌症中的程序性死亡受体1检查点通路、T淋巴细胞辅助细胞(T helper cell, Th)1和Th2细胞分化以及铁死亡通路等。见图2D。

本研究使用R语言软件包glmnet整合了生存时间、生存状态和37个铁死亡相关基因表达数据，建立了LASSO-COX模型。

将Lambda值设置为0.01，最终得到15个可以用于预测EOPE的差异表达基因，构建的模型公式如下：

风险评分＝0.6523×IFNG＋0.671×AKR1C1＋0.0728×CAV1＋0.5090×SLC1A4＋0.774×ENPP2－1.2547×ACVR1B－0.3275×ULK1－2.0401×ZNF419－0.2413×BID－0.5179×XBP1－0.2222×GPX4－0.1859×MAPK14－0.7165×WIPI1－0.4882×DPP4－0.578×SLC7A5。

最后，利用R语言软件包pROC的接收者操作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)函数分析得到最终的曲线下面积(area under curve，AUC)，如GPX4为0.61，95%CI: 0.68～0.54，进一步验证了LASSO-COX结果，GPX4等铁死亡相关基因与EOPE具有相关性。

利用Metascape工具，根据上述15个铁死亡相关基因富集的通路和生物学过程，进行分组构建网络。

具体来说，在15个铁死亡相关基因富集的term中，选择富集程度较高的，然后根据功能相关性聚类成几类，根据相关性和相似性构建网络。

图3A中不同颜色代表不同类别，显示15个铁死亡相关基因参与肌萎缩侧索硬化过程、T细胞活化调节、铁死亡、细胞迁移正调控及细胞因子产生正调控。

图3B按富集程度着色，颜色越深，在这种途径或生物过程中富集的基因数量越多。

根据15个铁死亡相关基因生成其相关蛋白相互作用网络，图3C和图3D显示了所有15个基因相关蛋白的全连接相互作用网络。

图3E的结果表示富集的通路，颜色深浅代表富集程度，后面是GO富集的term等信息，初步阐述15个铁死亡相关基因主要参与肌萎缩侧索硬化、调节T细胞活化、铁死亡、细胞迁移正调控及细胞因子产生等信号通路的正调控过程中发挥作用。

图3 Metascape和String的15个铁死亡相关基因的蛋白质-蛋白质相互作用网络  A：按集群ID着色，其中共享相同集群ID的节点通常彼此靠近；B：按p值着色，其中包含更多基因的术语往往具有更显著的p值；C，D：基因列表中确定的蛋白质-蛋白质相互作用网络和MCODE成分；E：涉及15个铁死亡相关基因的前11个簇及其代表性富集项

我国的产科相关指南将需在妊娠34周前因PE而终止妊娠者定义为EOPE，这与国际上的一些指南相一致^[12]。EOPE与LOPE不仅仅是发病时间上的差异，发病机制和预后也有差异，严重影响母胎结局，是产科医师面临的挑战。EOPE胎盘功能明显异常，为胎盘源性疾病，LOPE由母体及环境等多重因素参与发病。EOPE起病早、发展快、预后差，其发病机制仍不十分清楚，继续研究胎盘功能如何发生障碍，对预防EOPE十分重要^[12-13]。

任丹玉和王永红^[14]认为PE是一种严重的妊娠期并发症，用凝血功能指标和血小板参数的最佳截断值可以筛查PE。欧海蔚等^[15]认为EOPE患者血浆外泌体中微小RNA(micro RNA, miRNA)表达谱发生显著改变，认为这些差异表达的miRNA，特别是miR-152可能参与了PE的发生与发展。

林岩^[16]研究发现，铁死亡相关基因GPX4的rs713041位点多态性可能与PE遗传易感性有关联，认为GPX4可能作为预测PE的一个潜在靶点。宋鹏书等^[17]进一步研究发现PE孕妇外周血中的氧化应激因子环氧合酶2和胎盘组织中的铁死亡标志物GPX4表达异常，氧化应激反应及铁死亡可能参与PE的发病过程。