新生儿坏死性小肠结肠炎(nerotizing enterocolitis，NEC)是危及新生儿生命的严重疾病，主要见于早产儿。随着新生儿重症监护技术的发展，早产儿的生存率不断提高，但NEC的发生率未见明显下降。NEC的发病率约为1%~3%，病死率约为15%~30%^[1,2,3]，而在极低出生体重儿中发病率达5%~16%，病死率高达20%~50%^[4]。同时，NEC还可引起多种后遗症，如短肠综合征、生长与神经发育障碍等。目前NEC的临床诊断是基于临床表现、实验室检查和影像学的综合评估，但其临床表现及实验室检查缺乏特异性，典型影像学表现出现相对延迟，可造成早期识别及诊断困难，延误病情，故亟需提高诊断效率的指标指导临床医生尽早准确判断病情并加以干预以改善预后。NEC病因及发病机制复杂，研究认为NEC的发生与肠道微生物失衡、炎症介导的肠道损伤密切相关，与此相关的非侵入性生物标志物成为NEC研究的热点，许多生物标志物在NEC预测、诊断、疾病严重程度及预后评价等方面显示出一定价值。现对近年来NEC相关的生物标志物研究进展进行综述。

1.1　肠道脂肪酸结合蛋白(intestinal fatty acid-binding protein，I-FABP)

I-FABP是由肠上皮细胞分泌的一种小分子水溶性蛋白，具有器官特异性。生理情况下，血液循环中仅有少量I-FABP，当肠道缺血时，肠黏膜绒毛被破坏，细胞膜通透性增加，I-FABP可通过细胞膜、毛细血管、毛细淋巴管和门静脉快速进入血液^[1]。

检测血清I-FABP不仅可以协助诊断NEC，还能反映NEC的严重程度及预后^[1]。研究显示，在NEC治疗前，重症组(ⅡB期、Ⅲ期)患儿血清I-FABP的浓度明显高于轻症组(Ⅰ期、ⅡA期)^[5]。有学者动态监测NEC组患儿、非NEC组患儿(包括败血症、巨结肠、痢疾)在确定诊断6 h、24 h、72 h内的血清I-FABP浓度并与健康对照组比较，发现NEC组患儿各时间点的血清I-FABP浓度均高于非NEC组患儿，健康对照组最低。两组患儿血清I-FABP浓度均在6 h达到高峰，但下降时间NEC组明显迟于非NEC组(72 h比24 h)，提示NEC患儿肠道损伤较其他疾病修复慢^[6]。除此之外，血清I-FABP还能够预测死亡。在NEC组中，死亡患儿6 h、24 h血清I-FABP浓度均明显高于非死亡患儿。因此，监测血清I-FABP可提高NEC的早期识别率，其动态演变可能是预测NEC预后的重要指标。研究显示，当血清I-FABP的界值为37.95 μg/L时，诊断NEC的敏感性、特异性均为100%^[5,6]。一项包含7项研究、217例病例的Meta分析显示，I-FABP诊断NEC和手术NEC的敏感性分别为64%和71%，特异性分别为91%和76%^[7]。总体而言，血I-FABP可作为NEC诊断的潜在生物标志物，特异性较强，但敏感度略差。在预测NEC方面，Abdel-Haie等^[8]发现NEC组患儿在生后24 h内血清I-FABP较对照组明显升高，当界值为7.75 μg/L时，预测NEC的敏感性、特异性分别为94.4%、100%，但该研究中NEC患儿仅18例，还需要进行大规模的研究。

综上，血清I-FABP对NEC预测、早期诊断、严重度评估、预后等方面均具有潜在应用价值，特别是对诊断NEC特异性较高，但敏感性还有待提高。

1.2　炎症细胞因子

NEC发病受许多危险因素影响，绒毛膜羊膜炎、肠道缺血、细菌定植、输血等均可触发包括肠道细胞信号传导、肠道微生物群和细胞因子在内的复杂肠道免疫系统的炎症反应并伴有血清炎症细胞因子的改变，这种炎症反应甚至在NEC出现症状前就已经存在^[9]。

血清白细胞介素(interleukin，IL)-6是一种重要的急性期炎症介质，其刺激肝细胞产生急性期蛋白；IL-8是CXC趋化因子家族的一员，其主要效应是招募中性粒细胞到炎症部位，两者均是常见的促炎细胞因子；相反由Treg细胞分泌的IL-10是常见的炎症抑制因子。研究表明，IL-6界值为1 440 pg/ml时，NEC发病时预测手术的敏感性为91.7%，特异性为83.3%^[10]。另外，NEC内科治疗组和手术治疗组在生后72 h内IL-6、IL-8和IL-10水平即存在差异，手术治疗组的IL-6、IL-8水平较内科治疗组更高，而IL-10水平则更低^[9]。近年来，IL-27、IL-33也被证明在NEC患儿中明显升高，并与严重程度呈正相关，两种细胞因子在NEC手术治疗组均显著高于内科治疗组^[11,12]。在诊断NEC 24 h内，IL-33较IL-6在预测手术方面具有更好的准确性(AUC 0.838比0.667)^[12]。IL-27还能够区分NEC与食物蛋白诱导的小肠结肠炎综合征，两者在临床表现及影像学上难以分辨，但IL-27水平在NEC患儿更高，当界值为1 055.17 pg/ml时，敏感性和特异性分别为88.37%和75.81%，AUC为0.878，其敏感性及AUC均优于IL-6(敏感性44.64%，AUC为0.761)^[11]。

NEC与炎症密不可分，但作为NEC的生物标志物，炎症细胞因子具有非特异性，在区分其他感染性疾病方面价值有限，其更重要的临床意义在于协助评估NEC的严重程度。

1.3　瓜氨酸

瓜氨酸主要在肝脏及肠道中合成，肝脏中产生的瓜氨酸在原位进行分解代谢，血液中测定的瓜氨酸几乎完全由肠内细胞分泌。因此，血清瓜氨酸浓度可反映肠道生物合成，并受肠细胞功能变化的影响，是肠道功能的良好指标^[13]。

Jawale等^[13]对NEC患儿在症状出现24 h内的血清瓜氨酸水平进行监测，结果提示在Ⅱ期及以上NEC患儿中血清瓜氨酸水平显著低于Ⅰ期NEC组和健康对照组；确诊NEC的患儿经过治疗后，血清瓜氨酸水平回升，故动态检测血清瓜氨酸水平能反映肠道恢复情况。当瓜氨酸浓度界值为15 μmol/L时，诊断NEC的敏感性为78%，特异性为89%。因此，监测血瓜氨酸浓度可以协助早期诊断NEC。然而机体代谢是个复杂的过程，一种物质可能在机体代谢网中参与不同代谢，喂养方式、微生物群等也可对其产生影响，故瓜氨酸在NEC中的价值还需要更多的前瞻性研究予以明确。

2.1　I-FABP

肠上皮细胞分泌的I-FABP进入血液后，通过尿液进行排泄，血I-FABP与尿I-FABP有较强相关性，检测尿I-FABP能减少反复抽血造成的医源性贫血，故尿I-FABP可能成为替代血I-FABP的NEC标志物^[1]。

尿I-FABP可以协助早期诊断NEC，且浓度与病情严重度呈正相关，随疾病恢复而下降^[2,14]。一项meta分析显示尿I-FABP、尿I-FABP/Cr诊断NEC的敏感性分别为64%、78%；特异性分别为73%、75%^[7]。尿I-FABP在区分NEC与败血症方面也显示出较好的价值^[2]。在一项相关研究中，研究者从疑似发生NEC起，每间隔6 h监测尿I-FABP，最终诊断NEC者在起病12 h内的尿I-FABP浓度明显高于最终诊断败血症者，有利于早期鉴别NEC与败血症。此外，该研究还发现相对于X线下的肠壁积气和超声下的门静脉积气，尿I-FABP在诊断NEC方面表现出更好的敏感性和阴性预测价值。尿I-FABP还可用于预测NEC并发症。Kuik等^[15]研究发现NEC患儿再次喂养的第一天，高水平尿I-FABP预示着发生肠狭窄并发症的风险较高。当尿I-FABP/Cr界值为4.13 ng/g时，预测肠穿孔的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为100%、76.19%、44.4% 、100%^[16]。虽然尿液标本具有无创的优势，但尿I-FABP诊断NEC的敏感性、特异性相对较低；血液标本虽然有创，且可能造成医源性贫血，但可以随时获取，便于监测。血尿标本各有优劣，两者在NEC中均显示出一定的应用价值，若将两者联合应用可能发挥更大作用。

2.2　前列腺素E₂主要尿代谢产物(prostaglandin E₂ major urinary metabolite，PGE-MUM)

前列腺素E₂是由炎症状态下的肠道产生的，PGE-MUM在尿液中含量稳定，有报道PGE-MUM可作为肠黏膜炎症的一个有用的生物标志物^[17]。

NEC的发病与肠道炎症反应密切相关，故PGE-MUM也可能是NEC有用的生物标志物。Konishi等^[17]研究证实PGE-MUM可反映NEC的严重程度，NEC组PEG-MUM浓度高于健康对照组，且除了肠穿孔NEC外，Ⅲ期组患儿PGE-MUM浓度高于Ⅱ期组，对于接受手术治疗的患者，坏死肠段长度与PGE-MUM呈正相关。与肠道炎症标志物钙卫蛋白相似，PGE-MUM并非NEC的特异性指标，因此还需要更多的研究来探索PGE-MUM与其他生物学标志物的协同价值。

3.1　钙卫蛋白

钙卫蛋白是一种钙锌结合胞质蛋白，属于S100蛋白家族，是肠道炎症的标志物，其主要存在于中性粒细胞胞质颗粒中，在肠道炎症反应激活时释放，可通过粪便检测^[18]。

研究表明，NEC患儿粪钙卫蛋白(fecal calprotectin，FC)浓度高于非NEC者，且病情越重浓度越高^[19]。一项纳入了10项研究的meta分析显示FC具有较好的诊断性，其早期诊断NEC的综合敏感性和特异性分别为86%和79%^[20]。然而FC在NEC中的诊断价值仍存在争议，这主要与其生理浓度变异较大有关。有学者前瞻性收集有NEC危险因素新生儿的粪便，研究后发现个体间、个体内的FC浓度变异均较大，从NEC发病前至确诊NEC，病例组与对照组比较未见明显差异^[18]。研究发现62%的极低出生体重儿在出生后第一周的FC浓度较高(≥200 μg/g)，不同胎龄组在生后第3、4周FC浓度均呈现升高趋势，随后出现下降^[21]。鉴于这种生理变异，临床需要更多FC参考范围的数据。MacQueen等^[22]在建立了不同矫正胎龄健康早产儿FC的参考区间的基础上，进行NEC评估时，58%NEC患者FC浓度高于参考范围上限，只有13%非NEC患者FC浓度超过参考范围上限。故在确定FC参考范围的基础上，高于参考范围上限对诊断NEC仍有帮助。综上所述，FC的正常浓度范围存在较大波动，这限制了FC在NEC中的应用，但如果能确定FC浓度的参考区间，对于NEC的诊断仍是有意义的。

3.2　肠道碱性磷酸酶(intestinal alkaline phosphatase，IAP)

IAP由肠上皮细胞分泌到肠腔，是一种肠道保护蛋白。IAP基因敲除的大鼠，其肠道菌群的多样性减低，菌群移位、肠道炎症出现及肠道通透性增加^[23]。IAP还可使革兰阴性菌脂多糖去磷酸化，阻断脂多糖通过Toll样受体介导的促炎信号级联反应^[24,25]。与NEC发病相关的早产、配方奶喂养均可影响IAP的表达及活性^[25]。

既往研究表明，NEC患儿IAP浓度增高，但活性降低，且IAP生物活性与NEC严重程度呈反比。用IAP含量和IAP活性诊断严重NEC，AUC分别为0.97、0.97；用IAP含量和IAP活性诊断疑似NEC，AUC分别为0.76、0.62；但是当用于诊断败血症时，AUC分别为0.52、0.52^[24]。用IAP作为NEC诊断的生物标志物具有较高的准确性，但对败血症诊断的准确性明显降低，这也体现了两者发病机制的差异。鉴于NEC与败血症的临床表现相似，临床上难以区分，而IAP能够区分NEC与败血症，所以IAP可能成为NEC早期诊断的潜在生物标志物。

3.3　挥发性有机化合物(volatile organic compounds，VOC)

粪便VOC是由肠道内容物经消化、发酵产生的物质，受肠道微生物群的影响，VOC可快速反映微生物失衡。由于NEC的临床前阶段与肠道微生物组成的改变有关，VOC是预测NEC的潜在生物标志物^[3]。Probert等^[26]使用气相色谱-质谱连用仪检测诊断NEC前的VOC，发现了一个包括3-甲硫基丙醛、苯甲醛、2 -苯乙醛、2-甲基丙醛、3-甲基丁醇、2-甲基丁醇在内的VOC亚组，与NEC的发生呈正相关。研究发现，VOC在NEC发病前3d就已经发生变化，发病前2~3 d的VOC还能区分出NEC与败血症，敏感性、特异性分别为83.3%、75.0%^[3]。上述研究结果证实NEC发病前VOC就已经发生了变化，可能协助预测NEC的发生。

4.1　基因组学

越来越多的研究表明NEC与遗传易感性相关。目前与NEC相关的基因研究涉及炎症/免疫信号通路，氧化/抗氧化、血管内皮生长因子等，其中以炎症/免疫通路研究最多。

Toll样受体4介导的炎症信号通路激活是NEC发病的关键步骤，双特异性磷酸酶是由Toll样受体4激活的丝裂原活化蛋白激酶途径的负性调节因子^[27]。Talavera等^[27]研究发现，双特异性磷酸酶基因中单核苷酸多态性与NEC发病有关，rs704074单核苷酸多态性的存在能使NEC的发生风险降低48%，等位基因鸟嘌呤与NEC的严重程度相关，使手术NEC的发生率降低了78%。β₂整合素是Toll样受体信号通路的又一抑制因子，通过抑制核转录因子NF-κB的活化发挥作用，虽然尚未发现β₂整合素基因变异在NEC与对照组间存在差异，但其有害变异被证实与增加NEC严重程度相关^[28]。甘露糖结合凝集素(mannose-binding lectin ，MBL)是固有免疫系统的组成部分，MBL通过结合微生物中的甘露糖或糖基激活补体系统，在固有免疫和炎症反应中发挥重要作用^[29]。在新生儿中，低水平的MBL还可导致败血症发生风险增高。Dogan等^[29]对116例早产儿的MBL2基因进行分析，MBL2基因纯合组(n＝47)均未发生NEC，MBL2基因野生组(n＝69)有9例发生NEC，推测MBL2纯合基因型对NEC具有保护作用。

虽然基因检测可以提前发现有患病风险的新生儿，但有易感基因并不意味着均会发病，基因与基因间、基因与环境间的复杂相互作用均可影响NEC的发生。

4.2　肠道微生物组学

新生儿肠道菌群定植在出生前后快速开始，受分娩方式、喂养方法、早期使用抗生素等因素影响，肠道菌群的种类和丰度在健康新生儿和NEC患儿间存在差异。微生物失衡在NEC发病中发挥了关键作用^[30]。

虽然目前尚未明确何种肠道细菌是NEC的病原体，但NEC患儿肠道菌群多样性低于健康早产儿。在NEC患者的粪便样本中，大肠杆菌和粪肠球菌是相对丰度较高的主要菌种，而常见的婴儿肠道共生菌，如放线菌属、沙利亚菌属、细孔菌属、拟杆菌属和链球菌属的种类减少或缺失，厚壁菌门减少，变形菌门增加^[31]。Olm等^[32]的研究表明，NEC诊断前肺炎克雷伯菌的丰度较高，在诊断NEC的2 d前，所有细菌的复制率明显升高，特别是肠杆菌科。类似地，Dobbler等^[33]检测出在NEC发病前有3种肠杆菌科细菌在NEC患儿中具有较高丰度，依次为柯氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌，并伴有乳杆菌丰度下降。可见NEC发病不单是某一种肠道细菌作用的结果，涉及到多种肠道菌群的复杂变化，检测新生儿粪便菌群变化可能成为协助预测及早期诊断NEC的手段。