中华医学会围产医学分会

摘要

随着新生儿重症医学的发展，极早产儿和极低出生体重儿的生存率明显提高，支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)的发病率也呈逐年增加的态势。BPD的发病机制尚未明确，目前认为炎症是其发生发展中的重要环节。中性粒细胞可利用其产生的中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)来捕捉并杀死病原体和减轻炎症，但过量形成的NETs易诱发炎症失衡，从而损伤正常细胞或组织，参与BPD的病理生理过程。该文综述NETs的结构、形成、功能和在BPD中的调控作用，及NETs在BPD中的针对性治疗方案和可能的研究方向。

Advances in neutrophil extracellular traps in bronchopulmonary dysplasia

Due to the development of neonatal intensive care, the survival rate of very preterm infants and very low birth weight infants has been significantly improved, and the incidence of bronchopulmonary dysplasia (BPD) has been obviously increasing year by year.The pathogenesis of BPD has not been clear, it is considered that inflammation is an important link in the occurrence and development of BPD at present.Neutrophils can use their neutrophil extracellular traps (NETs) to capture and kill pathogens and reduce inflammation, but excessive formation of NETs is easy to induce inflammatory imbalance, so as to damage normal cells or tissues and participate in the pathophysiological process of BPD.This paper reviews the structure, formation, function and regulatory role of NETs in BPD, and the targeted treatment strategies and potential research directions of NETs in BPD.

支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)是一种常见的影响患儿存活率及预后的慢性肺功能障碍性疾病。BPD发生的原因尚未明确，临床上常见的危险因素包括早产、感染、氧中毒等，但随着研究的深入，炎症反应越来越受到关注^[1,2]。中性粒细胞作为一种固有免疫细胞，参与机体免疫反应，在疾病的早期就能抵御病原体的扩散。活化的中性粒细胞通过其释放的趋化因子募集到肺部，发挥释放炎性介质、吞噬及杀死病原体等作用^[3]。既往研究发现，中性粒细胞可通过形成一种特殊形式的生物结构参与机体防御，在接受刺激后释放一种丝状体物质——中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)，这种由核酸物质组成的NETs总是在病原体进入人体后，很快就出现在炎症部位周围并能有效地杀灭病原微生物，是一种新的中性粒细胞实现宿主防御作用的免疫机制^[4]。NETs能有效控制或减少肺部的感染及炎性疾病的发生，但新近研究表明，过度形成的NETs对肺部多种细胞组织有直接的细胞毒性作用，如上皮细胞、血管内皮细胞^[5]。基于此，本文综述了NETs的形成机制及对BPD的调控作用，及NETs在BPD中的针对性治疗方案和可能的研究方向。

1　NETs的研究背景

1.1　NETs的结构特征

中性粒细胞是机体固有免疫反应的重要效应细胞，在机体感染或损伤过程中参与早期宿主防御反应，具有趋化、选择性吞噬和杀菌等作用^[6]。当中性粒细胞在与入侵的病原微生物反应时，会被激活释放出染色质和大量的颗粒蛋白物质，它们共同形成了细胞外纤维，即为NETs^[7]。Brinkmann等^[8]在高分辨率扫描电子显微镜下发现，NETs具有特殊的三维网状超微结构，是以DNA网状结构为基本骨架，其间镶嵌有多种来自嗜天青颗粒的蛋白如中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)、瓜氨酸化组蛋白等。

1.2　NETs的形成机制

Fuchs等^[9]在2007年证实NETs的形成是中性粒细胞程序性死亡的最后一步，与其他细胞死亡过程(例如细胞凋亡、坏死或细胞焦亡)相比，染色质去浓缩是NETs形成的主要特征，而且中性粒细胞释放NETs后会引起自身的死亡，这种特别的死亡方式被称为中性粒细胞胞外诱捕网式死亡(NETosis)。目前研究发现NETs的产生形式主要有自杀式NETosis和活性NETosis两种^[10]。自杀式NETosis通常在佛波酯(PMA)激活蛋白激酶C和Raf/MERK/ERK信号通路后启动，也称为经典活性氧依赖途径，是目前了解最多也是最主要的一种模式^[11]。当中性粒细胞识别刺激因素后引起呼吸爆发氧化酶复合物活化，刺激活性氧产生。在活性氧的影响下，颗粒和核膜破裂，去聚化的染色质和细胞质内容物混合，最终胞膜破裂，形成的NETs释放至细胞外发挥作用，该过程会伴随着中性粒细胞的降解死亡^[12]。活性NETosis依赖于DNA的释放，主要包括线粒体DNA释放式NETosis和细胞核DNA释放式NETosis两种模式。中性粒细胞激活是NETosis的先决条件，区别在于是否依赖于活性氧的产生。线粒体DNA释放式NETosis依赖于不需要呼吸爆发氧化酶介导的活性氧，而细胞核DNA释放式NETosis则不依赖活性氧，颗粒、核膜和胞膜均未被破坏。此外，补体因子C3和Toll样受体4可促进细胞核DNA释放式NETosis^[13,14]。

1.3　NETs的功能

中性粒细胞在骨髓中分化发育成熟后进入血液或组织，并被各种炎症因子介导到感染部位^[15]，在IL-8、脂多糖、PMA等刺激下产生NETs，具有结合和杀死病原体的作用，并确保在炎症部位有高浓度的抗菌成分而有效地发挥作用^[16]。NETs不仅可以抵御多种入侵的病原体，还可以利用NETs的蛋白水解活性降解细菌毒力因子^[17]。除了抗菌特性外，NETs还可以作为一种物理屏障，将颗粒蛋白纳入其中，可能会阻止潜在的蛋白酶扩散及炎症部位附近组织的损伤^[18]。NETs通常发挥抗菌、抗炎等保护性作用，但有研究表明，过量产生的NETs若未及时清除，还可作为一种自身抗原，导致炎症失衡，直接引起细胞和组织的损伤，参与疾病过程^[19]。

2　NETs在BPD中的调控作用

2.1　BPD的发病机制

BPD是早产儿常见的一种呼吸系统慢性疾病，目前关于其确切机制仍在探索之中^[20]。机械通气、感染等对早产儿肺造成的损伤是早产儿BPD发病机制之一^[21]。这些事件都会加重肺部炎症反应，释放的大量促炎细胞因子如IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等以及生长因子(转化生长因子)和血管生成因子(血管内皮生长因子、血管生成素2)导致肺泡发育不全、微血管生成障碍和异常组织修复，引起反复的呼吸道感染、肺动脉高压等，最终导致早产儿病死率增加^[22,23]。炎症在BPD的发生发展中扮演着重要角色，这是由于早产儿各个系统机能的发育较足月儿都相对落后，抗氧化应激系统发育也不完善，不成熟的肺暴露于高氧，聚集于肺部的炎症细胞释放大量炎症因子，触发炎症级联反应，加上内源性抗氧化酶的严重缺乏，最终可导致BPD患儿肺损伤和发育停滞^[24]。

2.2　NETs介导BPD的机制

有效的中性粒细胞凋亡可导致炎症反应的消退，但近期研究报道NETs可能代表了另一种更具致炎作用的细胞死亡形式^[25]。NETs成分通常起到抗菌作用，但根据炎症反应的部位、时间、范围和严重程度，NETs也可能会通过多种途径导致炎症和组织损伤^[26]。因此，NETs形成过多或未被及时清除时，可局部形成蛋白水解环境、介导自身免疫、形成损伤相关分子模式的NETs、损伤肺血管内皮导致肺部微循环障碍，参与BPD的发生与发展。

2.2.1　NETs的蛋白水解活性

NETs中含有NE、组织蛋白酶等多种丝氨酸蛋白酶，这些蛋白酶聚集在炎症部位会水解蛋白，从而损伤了肺上皮细胞的完整性，加重BPD^[27]。NE作为NETs中含量较丰富、活性较强的蛋白水解酶，对启动NETs形成至关重要，与其他蛋白酶协同驱动染色质解聚，水解细胞外基质，破坏细胞间连接^[28]。除了上述细胞内途径，在机体感染期间NE也被释放到细胞外，膜结合的NE能抵抗抗蛋白酶系统的抑制作用，因此保留了其蛋白水解的作用，过度表达的NE会持续存在于肺组织中加重炎症反应^[29]。

2.2.2　NETs介导自身免疫

NETs可以触发BPD患儿感染过程的免疫细胞，如单核细胞和巨噬细胞，通过NLRP3炎性小体释放IL-1β，是促炎环境持续存在的原因^[30]，会加剧BPD的炎症反应，逐渐恶化BPD患儿的肺组织并最终导致多器官衰竭和死亡。NETs在自身免疫性疾病初期发挥着重要作用，它使细胞内源性成分完全暴露于免疫系统而产生自身抗体，为免疫系统对自身抗原不耐受的病理状况^[31]。

2.2.3　损伤相关分子模式的NETs

NETs中的多种成分都可作为损伤相关分子模式以启动进一步的炎症反应，其中高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)的作用最明显^[17]。有研究向大鼠气管内注射HMGB1，发现TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎细胞因子以及TLR4蛋白和mRNA显著增加，并且与HMGB1呈剂量相关性，组织病理提示肺组织有明显的变化，表现为肺泡间隔增宽、间质水肿、毛细血管扩张及炎性细胞浸润，这提示了HMGB1可作为损伤相关分子模式的NETs加重肺部损伤过程^[32,33]。

2.2.4　NETs参与凝血过程

研究表明，炎症部位过度形成的NETs可能会引起肺血管内皮的损伤及管腔中血栓形成，导致微循环障碍，阻碍了肺泡的气体交换，加速了BPD的发生发展^[34]。Varjú等^[35]证实了NETs中的组蛋白和DNA增加了纤维蛋白纤维的直径，纤维蛋白纤维在体外条件下构成了血凝块的支架。此外，还观察到DNA会影响纤溶酶原活性的降低，而组蛋白则有助于通过抗凝血酶抑制凝血酶作用。

3　NETs在BPD治疗中的潜在应用

3.1　促进NETs清除

DNA是NETs的主体部分，这是由于用脱氧核糖核酸酶(DNase Ⅰ)干预后观察到NETs失去活性，失去抗菌作用，而用蛋白裂解酶处理NETs后其功能不受影响，证实了DNA结构是NETs促进炎症反应的基础^[36]。Reiter等^[37]通过7例病例首次描述了DNase Ⅰ在治疗接受机械通气的早期BPD患儿中的作用，结果表明在DNase Ⅰ治疗期间，患儿在各个时间点的呼吸机需氧量均有所下降。近期德国的一项研究表明，DNase Ⅰ与无污染的亲水性微凝胶结合明显提高了DNase Ⅰ在血清中的稳定性，从而降低NETs介导的炎症反应和微血栓形成^[38]。2018年，荷兰鹿特丹索菲亚儿童医院对2例呼吸道合胞病毒细支气管炎并伴有大量单侧肺不张的婴儿，以及3例需机械通气的婴儿(2例新生儿，1例患有BPD)，每天接受两次雾化吸入2.5 mg重组人DNase治疗，临床观察到雾化重组人DNase后肺不张的消退和临床症状的改善与预期一致^[39]，这对新生儿BPD的治疗也有所启示。此外，目前已有实验探究IL-37在促进巨噬细胞摄取NETs方面的作用，并提出NETs被巨噬细胞中的胞质外切核酸酶TREX1降解，而且发现从树突状细胞释放的DNase Ⅰ L3介导NETs的细胞外降解^[38]。上述研究结果提示NETs可能作为BPD的治疗靶点，为治疗BPD提供了新的切入点。

3.2　抑制NETs形成

NETosis是通过一个保守细胞事件的逐步序列进行的，并且需要肽酰基精氨酸脱亚氨酶4(peptidylargrinine deiminase 4，PAD4)的存在才能使DNA从细胞核和细胞膜中释放出来，因此抑制PAD4的活性就可以减少NETs的产生，缓解过度炎症反应造成的肺部损伤^[40]。Lefrançais等^[41]利用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染敲除PAD4的实验小鼠，通过抑制组蛋白精氨酸残留物的瓜氨酸化，从而达到了抑制染色质解聚的目的，与正常对照组比较，PAD4缺陷组小鼠骨髓中性粒细胞中NETs的平均含量显著下降，测定肺泡灌洗液中各物质的平均浓度发现蛋白的平均浓度下降。Lee等^[42]构建了高氧诱导的肺损伤小鼠模型，实验组在开始机械通气时连续7 d给予粒细胞集落刺激因子[50 μg/(kg·d)]，第7天用流式细胞仪检测CD45(dim/-)/Sca-1(+)/CD133(+)/(VEGFR-2)来确定内皮细胞的数量，结果发现与对照组相比，治疗组内皮细胞百分率明显升高。粒细胞集落刺激因子可通过增加血管生成因子改善BPD患儿血管发育迟缓以及缓解高氧抑制的发育中肺的肺泡化，这种促进血管增生及肺泡化的作用与动员内皮祖细胞和上调血管内皮生长因子信号传导有关。

脂氧素是大量中性粒细胞浸润引起的过度炎症反应过程中重要的内源性介质，具有很强的促进炎症消退的作用。在脂氧素的几种亚型中，脂氧素A4通过其抗炎、抗氧化和抗细胞凋亡作用能保护机体免受损伤。实验表明，外源给予脂氧素A4可以保护LPS诱导的大鼠肺组织，活化的脂氧素A4能有效减少中性粒细胞分泌NETs并抑制其与内皮的黏附，同时抑制肺组织匀浆中促炎因子TNF-α和IL-1β的释放，减轻了小鼠模型中肺损伤的程度，显著改善毛细血管通透性，减少局部和全身氧化应激反应，并减少大容量通气诱导的细胞凋亡，有效改善BPD患儿肺的远期结局^[43]。

有研究发现，抑制胞内嗜天青颗粒释放髓过氧化物酶和中性粒细胞弹性蛋白酶也能阻断核染色质解聚，以及使用NE抑制剂也能抑制NE活性以减轻肺损伤，但其临床疗效可能与疾病严重程度及其可能的并发症等因素相关，仍然需要研究来探讨对各种亚型BPD患者的治疗效果^[44]。

3.3　调节NETs平衡

近年来，IL-33在BPD发病机制中的作用备受关注。IL-33诱导的NETs通过弹性蛋白酶和其他酶降解肺组织中的纤维连接蛋白，出现肺泡结构简化引起肺发育阻滞。细胞损伤时IL-33从细胞核中释放出来，裂解为成熟形式后结合致瘤性抑制受体2 (ST2)并启动2型免疫反应。在BPD小鼠模型的研究中发现，针对IL-33受体的ST2中和抗体部分挽救了肺的发育，防止了肺泡数的减少。此外，IL-33抗体也被发现可以抑制上皮损伤和肺部炎症，有益于BPD小鼠的肺发育^[45]。升高的IL-33通过ST2诱导NETs的形成而加重BPD，因此，IL-33/ST2信号通路可能是BPD治疗的潜在方向。

肺组织中过量的NETs能通过NLRP3炎症小体引发巨噬细胞产生IL-1β，加重炎症反应，导致肺损伤。芒果苷是一种可以清除氧自由基的天然抗氧化剂，在巨噬细胞中以NF-κB依赖性方式抑制NLRP3炎症小体激活来防止肺损伤^[46]，这可能为BPD提供了一种可能的治疗药物。

NETs在巨噬细胞和树突状细胞中能调节LPS诱导的细胞因子反应。研究发现NETs减低了LPS对IL-10、IL-12分泌的影响，但在炎症部位过量产生的NETs和LPS共同刺激下，巨噬细胞和树突状细胞产生的血管内皮生长因子显著减少，抑制内皮细胞增殖，加重微血管损伤^[47]。因此，控制好NETs的生成量有助于改善肺微血管生成障碍。

4　小结与展望

NETs可以捕获和清除促炎介质来帮助减轻炎症反应，有助于防止病原微生物在肺部的扩散，促使其成为未来研究的潜在治疗目标。然而，越来越多的研究表明若NETs大量地长期存在于肺组织会加剧BPD的进展导致不可逆性的肺损伤，基于支持其作为炎症的有害成分的证据，有效地阻断NETs形成和抑制NETs活性可能有助于改善BPD的预后。最终目标是确定NETs何时形成以及如何发挥有益作用，如通过给予DNase Ⅰ或NE抑制剂都能有效减少NETs的产生，旨在寻找到临界点，创造一种倾向于"有益"而不是"有害"的平衡环境。

参考文献（略）

来源：国际儿科学杂志, 2023,50(4) : 257-261.

作者：余紫薇殷静钱云韩树萍

单位：南京医科大学附属妇产医院（南京市妇幼保健院）