本研究为病例对照研究。研究对象为2022年7月至2023年6月在北京大学第一医院进行规律产前检查的孕妇。本研究选择GDM孕妇作为病例组，并按年龄以1∶1比例匹配同期糖耐量正常孕妇作为对照组。病例组的纳入标准：（1）年龄18~45岁；（2）经75 g口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test， OGTT）诊断为GDM；（3）单胎妊娠；（4）在本院进行规律的产前检查；（5）签署知情同意书。病例组的排除标准：（1）孕前患有T1DM或T2DM，或糖耐量异常者；（2）孕前患有严重的基础疾病，如严重的心脏病和肝肾疾病等；（3）患有严重的妊娠并发症或传染性疾病（如梅毒、乙型肝炎等）。对照组的纳入标准：经75 g OGTT判定为糖耐量正常，其他同病例组。对照组的排除标准同病例组。本研究已得到北京大学第一医院生物医学伦理委员会批准（2022KY015）。

1．GDM诊断标准：按照国际糖尿病和妊娠研究组（International Association of Diabetes and Pregnancy Study Groups， IADPSG）的建议进行GDM诊断，在妊娠24~28周进行75 g OGTT，若符合以下任一项标准则诊断为GDM：空腹血糖≥5.1 mmol/L，服糖后1 h血糖≥10.0 mmol/L，2 h血糖≥8.5 mmol/L^［13］。

2. 样本量计算：采用PASS 2021软件计算研究所需样本量，考虑到多重检验［拟检测DNA片段中约20个胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（cytosine-phosphate- guanine，CpG）位点］，显著性水平α设为0.0025（0.05/20），双侧检验，检验效能为0.80，参考相关文献报道^［14］，病例组与对照组KCNQ1基因DNA甲基化水平（β值）中位数的差值设为0.0292，差值的标准差设为0.0800，结果显示，病例组与对照组所需样本量各107例。

3. KCNQ1基因启动子DNA甲基化检测：利用研究对象的空腹外周静脉血，采用磁珠法提取DNA，使用Zymo Research公司EZ DNA甲基化试剂盒参照标准操作流程对DNA进行亚硫酸盐转换，非甲基化胞嘧啶残基转化为尿嘧啶的效率大于99%，甲基化胞嘧啶的保护率大于99%。根据人类参考基因组序列GRCh38版本中KCNQ1基因DNA序列，使用EpiDesigner软件对KCNQ1基因启动子区域Chr11：2443747_2444161共415个碱基对进行扩增引物设计。正向引物为5'-AGGAAGA- GAGTTTAGTTTTTGTTTTAGGGTTGTGTG-3'，负向引物为5'-CAGTAATACGACTCACTATAGGGAG- AAGGCTCACCACTATCAAATACCTCCCAATA-3'。采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction， PCR）对经重亚硫酸盐转化的DNA中的目标序列进行扩增，反应条件设为94 ℃ 4 min，按照94 ℃ 20 s（变性），60 ℃ 30 s（退火）和72 ℃ 60 s（延伸）的顺序进行45个循环，72 ℃ 5 min，4 ℃保温。共扩增222例样品，其中221例成功，1例失败，失败样品的退火温度调整至58 ℃补扩增后成功扩增。PCR扩增产物经虾碱性磷酸酶处理、转录酶切反应和树脂纯化后，通过MassARRAY系统、采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法采集目标序列的质谱信号，使用EpiTYPER软件计算峰值、信噪比从而获得各CpG位点的甲基化水平，该方法被证明具有较好的准确性和稳健性^［15］。目标序列（Chr11：2443747_2444161）中共包含20个CpG位点，其中，CpG1因序列问题未能检出；CpG2和CpG13分子量相同，检测结果以两者平均值表示，故检测数据相同；CpG3_4、CpG6_7、CpG9_10_11和CpG18_19片段内由于相邻位点距离过近或因序列排列导致酶切时无法被切断，故检测结果为相邻位点的平均值，因此，本研究共纳入14个CpG位点/片段进行后续分析。

4. 资料收集：依照统一设计的调查问卷通过查阅医院电子病案系统，获得和记录研究对象的一般情况（分娩时间、孕前体重、产次等）、实验室检测指标（空腹血糖、75 g OGTT服糖后1 h和2 h血糖等）和体格检查指标（身高、体重、收缩压和舒张压等）。孕24周增重（kg）=孕24周体重（kg）－孕前体重（kg）。

采用SAS 9.4软件进行统计学分析。非正态分布的计数资料以M（P₂₅~P₇₅）表示，采用Mann-Whitney U检验进行组间比较。采用条件logistic回归评价KCNQ1基因启动子甲基化水平与GDM发病风险的关联，校正因素包括孕前体重指数、产次、收缩压、舒张压和孕24周增重。采用多元线性回归模型评估KCNQ1基因启动子甲基化水平与空腹血糖、服糖后1 h和2 h血糖水平的关联，校正因素包括孕前体重指数、产次、收缩压、舒张压和孕24周增重。P<0.05为差异有统计学意义。

研究期间，根据纳入排除标准，选择111例GDM患者作为病例组，以及111例年龄匹配的健康孕妇作为对照组。病例组的孕前体重、孕前体重指数、收缩压、空腹血糖、服糖后1 h和2 h血糖均高于对照组（P值均<0.05）。2组孕妇年龄、身高、产次、舒张压比较差异无统计学意义（P值均>0.05）。见表1。

表1  研究对象的一般情况在2组孕妇中比较[M（P25~P75）]

注：1 mmHg=0.133 kPa

胰岛素抵抗和胰岛素分泌异常与GDM和T2DM的发生密切相关，且GDM与T2DM具有相似的发病机制、遗传和表观遗传学危险因素^［16-17］。然而，相比GDM，既往对于KCNQ1基因DNA甲基化关联研究的探索主要聚焦于T2DM和胰岛素抵抗。2012年，Ribel-Madsen等^［10］在11对丹麦T2DM表型不一致同卵双生子代骨骼肌组织中发现KCNQ1基因cg17820828位点甲基化水平存在差异。基于欧洲人群的病例对照研究，在50例T2DM患者和70例健康对照外周血中识别了KCNQ1基因中3个T2DM差异甲基化位点^［11］。随后，Arpón等^［9］在523例糖耐量正常的巴西成人外周血中发现KCNQ1基因DNA甲基化与胰岛素抵抗存在关联。Hivert等^［12］通过EWAS在欧裔人群胎盘组织中发现KCNQ1基因DNA甲基化水平与母体胰岛素敏感性存在关联。此外，候选基因策略也提示KCNQ1基因DNA甲基化与T2DM和胰岛素敏感性存在关联。一项巢式病例对照研究在我国河南农村人群中纳入了290例T2DM患者和290例健康对照，发现KCNQ1基因中2个CpG位点的高甲基化水平与T2DM发生风险增加相关^［18］。Shah等^［19］基于510例30~60岁糖耐量正常的欧洲成人，对KCNQ1基因5个CpG位点进行甲基化检测，发现KCNQ1基因DNA甲基化与胰岛素敏感性相关。以上证据均在一定程度上为本研究发现的KCNQ1基因DNA甲基化与GDM发病风险的关联提供了支持。

KCNQ1基因位于人类染色体11p15.5区域，编码KvLQT1蛋白。有研究表明，KvLQT1蛋白表达增加能够抑制胰岛素分泌，而KCNQ1通路阻断则可促进胰岛素分泌^［21］。这可能由于KvLQT1蛋白通过调节胰岛β细胞膜电位和细胞体积，而调控胰岛素信号转导和代谢所致^［7-8］。此外，多项研究指出，KCNQ1基因多态性与GDM、空腹血糖、胰岛β细胞功能存在关联，且KCNQ1基因不同基因型可能通过引入或移除CpG位点而影响甲基化水平和基因表达^［22-24］。既往证据也显示，约48%的糖尿病候选基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism， SNP）位点可通过引入或丢失CpG位点而直接影响DNA甲基化水平^［25］。另一项欧洲研究指出KCNQ1基因rs231840位点碱基改变使甲基化位点丢失，导致甲基化水平降低，进而影响胰岛素敏感性^［19］。甲基化数量性状位点分析发现全基因组关联分析识别的若干糖尿病候选SNP位点与DNA甲基化水平存在关联，SNP与DNA甲基化的交互作用可以影响胰岛信使RNA表达、胰岛素分泌和糖尿病的发病风险^［26］。另外，有研究表明，甲基化介导的基因表达调控可能通过影响胰岛β细胞功能及外周组织胰岛素敏感性，在KCNQ1基因与T2DM的因果关联中发挥关键作用^［27-28］。动物实验也支持这一观点。Boini等^［29］通过基因敲除小鼠模型发现，KCNQ1表达降低能够导致全身胰岛素敏感性增强，肝脏和肌肉中胰岛素介导的葡萄糖摄取增加。另一项动物实验基于GDM子代小鼠的胰腺组织，发现KCNQ1基因DNA甲基化参与糖脂代谢及相关信号通路转导^［30］，这也提示KCNQ1基因DNA甲基化可能通过调节糖代谢而影响血糖水平。然而，本研究未进行基因表达相关检测，KCNQ1基因甲基化影响GDM的机制推测基于既往文献，需后续实验验证。虽然动物模型提示KCNQ1基因可能通过调节胰岛素敏感性影响糖代谢^［29-30］，但其在GDM中的作用仍需直接证据证实。

利益冲突声明 所有作者声明不存在利益冲突

参考文献：略