随着监护、救治技术的不断进步，新生儿的病死率逐渐下降，其远期神经发育结局已成为社会和家庭关注的首要问题。围生期阶段，发育中的大脑易遭受缺氧、出血、感染和炎症等因素影响从而造成不同程度的脑细胞损伤。研究发现新生儿体液中可检测到受损的脑细胞所释放的特异性蛋白，并且与新生儿脑损伤的发生和预后相关。该文主要综述近期报道较多的脑损伤生物标志物如S100B、神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白等在不同生物样本中的表达水平以及其对脑损伤的发生和神经发育的临床预测价值。Progress of major biomarkers for neonatal brain injury in clinical applicationWith the continuous progress of monitoring and treatment skills, the mortality of neonates has gradually decreased, and the long-term neurodevelopmental outcome has become the primary concern of society and families.During the perinatal period, the developing brain is vulnerable to hypoxia, hemorrhage, infection and inflammation, which may cause varying degrees of brain cell damage.Studies have found that proteins released by damaged brain cells can be detected in the body fluid of neonates, which are related to the occurrence and prognosis of neonatal brain injury.This article mainly reviews the recently reported brain injury biomarkers such as S100B, neuron specific enolase(NSE)and glial fibrillary acidic protein(GFAP)in different biological samples and its clinical predictive value for the occurrence of brain injury and neurodevelopmental prognosis.围生期发生的脑损伤，如缺血缺氧性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)、脑室内出血(intraventricular hemorrhage，IVH)和脑室周围白质软化(periventricular leukomalacia，PVL)等疾病可引起视听障碍、癫痫和脑瘫等不良神经发育结局，给家庭及社会带来沉重的心理和经济负担。现有的脑损伤评估措施如Apgar评分、乳酸浓度和pH值等常规指标往往缺乏特异性，而振幅整合脑电图(amplitude integrated electroencephalogram，aEEG)、颅脑超声及MRI等影像学检查方法不仅前期敏感度低且受设备、人员等因素影响，临床应用存在一定局限性[1]。新生儿脑损伤生物标志物研究旨在寻找可靠的、易获取的生物分子帮助临床医生早期发现脑损伤高风险病例，改善新生儿神经发育预后。其中S100B、神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)等是近几年在国内外研究中被广泛报道的脑损伤生物标志物。S100B(相对分子质量为21 000)是一种主要由神经胶质细胞产生的酸性钙结合蛋白，神经系统中含量最为丰富(90.9%)，肌肉(7.1%)和脂肪(1.77%)等组织中也有少量分布。脑损伤发生后，S100B立即从受损的胶质细胞中释放到外周循环，随后经肾脏(98%)排出，血液中的半衰期约为1.5 h，因此可作为急性脑损伤的生物标志物[2]。此外，S100B在唾液、尿液和羊水等体液中也可被检测到[3]。S100B的浓度不仅与脑损伤的发生及严重程度相关，而且受分娩方式、性别、胎龄和亚低温治疗等多种产前及产后因素的影响[4]。下文主要分述各类生物样本中S100B的特性及其应用。脐血采样便捷，不影响新生儿血容量，已成为新生儿脑损伤生物标志物的研究热点。Bouvier等[4]收集了200例健康足月儿及183例健康早产儿(34≤胎龄<37周)的脐血标本，首次提出了足月儿和早产儿的脐血S100B的浓度参考值(95%)分别为0.96 μg/L和1.36 μg/L，与足月儿相比，晚期早产儿脐血S100B浓度偏低。同时，该研究还发现单独以脐血S100B浓度>1.27 μg/L为阈值时预测新生儿脑损伤(包括HIE、硬膜下出血、脑积水等)的曲线下面积(area under the curve，AUC)为0.67；以脐血pH<7.25为阈值预测脑损伤的AUC为0.68；两者协同可将AUC提升至0.76。Zaigham等[5]比较了中重度HIE新生儿(n＝13)和健康对照新生儿(n＝21)脐血S100B的浓度差异后发现，HIE新生儿脐血S100B的浓度明显高于对照组；S100B浓度增加与脐血酸中毒、aEEG异常、HIE严重程度及学龄期死亡或神经后遗症有关。因此，脐血S100B水平或可协同动脉pH值和生后Apgar评分等非特异性指标，早期预警新生儿脑损伤的发生，有助于临床决策。外周血来源的S100B水平对于不同胎龄的新生儿脑损伤均有一定的预测作用。Metallinou等[6]根据早产儿(胎龄<34周)住院期间颅脑超声结果筛选出29例脑损伤早产儿(PVL＝19，IVH＝12)，并按照胎龄和出生体重匹配了29例颅脑超声结果正常的对照组。该研究发现，生后3 d内脑损伤组早产儿的外周血S100B的浓度均高于对照组并呈时间下降趋势；第1天对照组外周血S100B浓度为4.84 μg/L，而在早期死亡或出现惊厥和肌张力异常的重度脑损伤组中高达20.66 μg/L；该日龄的外周血S100B水平对于重度脑损伤的预测性最佳，以10.51 μg/L为临界值的敏感度可达100%，以17.74 μg/L为临界值的特异度可达100%。新生儿脑病(neonatal encephalopathy，NE)是指近足月儿(胎龄≥35周)发生的以意识状态改变和(或)肌张力及反射异常为特点的神经障碍综合征，如有围生期窒息因素时，NE和HIE常被视作同一诊断。Efstathiou等[2]在一项前瞻性队列研究中纳入了36例足月儿(NE组＝24，对照组＝12)，并且在生后第1天、第3天、第9天及第18天分别获取外周血以探讨S100B的浓度变化。结果提示足月儿外周血S100B的浓度同样呈时间下降趋势；生后第1天重度NE组外周血中S100B的平均水平较对照组升高10倍以上，此时外周血S100B的浓度对重度NE和神经发育障碍的预测性最佳；以1.6 μg/L作为临界点预测重度NE的敏感性和特异性分别为87.5%和88.5%；以11.4 μg/L作为临界点预测2岁内早期死亡或脑性瘫痪的敏感性和特异性分别为66.7%和100%。亚低温治疗是针对NE的有效管理措施。Catherine等[7]对比了亚低温治疗对于中重度HIE新生儿外周血S100B的影响后发现，72 h后亚低温组外周血S100B的浓度与未接受亚低温治疗的对照组相比无显著统计学差异。总之，新生儿生后第1天外周血S100B的浓度异常升高即可早期预示脑损伤的发生及脑发育不良结局，但是亚低温治疗对于外周血S100B浓度的影响亟需更多数据验证。脑室出血后脑室扩张(posthemorrhagic ventricular dilatation，PHVD)是重度IVH常见的并发症之一，增加了早产儿死亡和神经系统不良结局的风险。研究发现，罹患PHVD的极低出生体重早产儿脑脊液S100B的浓度较脑发育正常者可升高5~10倍左右，且与脑实质病变程度、12月龄神经发育异常和死亡有关[8]。足月儿方面的研究也显示无脑损伤的对照组新生儿生后第4天脑脊液中S100B的浓度远低于窒息组新生儿，并且在重度NE和早期死亡的新生儿中脑脊液S100B水平可见进一步升高[9]。亚低温治疗对脑脊液S100B的浓度变化影响较为明显。Sun等[10]发现亚低温治疗不仅可导致HIE新生儿脑脊液中NSE浓度下降，而且下降程度往往与12月龄神经发育有关。综上，早产儿和足月儿脑脊液S100B水平均对脑损伤的程度和预后有较强的预测性，但鉴于脑脊液样本获取属于有创性操作且不适用于动态纵向监测，使其临床应用受到局限。尿液样本收集具有非侵入性、可纵向测量的优点。Gasparroni等[11]动态分析了极早产儿生后96 h内的尿液后发现，IVH早产儿(n＝36)生后首次尿液中S100B的浓度即高于无IVH对照早产儿(n＝180)，并且在96h内逐渐升高，而在对照组早产儿中却并未发现上升迹象；尿液中S100B的浓度升高与IVH严重程度及各脑区(白质、皮层灰质、深灰质、小脑)MRI异常评分相关。尿液S100B也可用于评估亚低温治疗新生儿窒息的有效性。Bersani等[12]比较了亚低温治疗对HIE新生儿尿液S100B浓度变化的影响后发现，未接受亚低温治疗的中重度HIE新生儿生后5 d内尿液S100B的浓度均呈缓慢升高趋势，而亚低温治疗的中重度HIE新生儿尿液S100B在生后4~24 h出现暂时性升高后逐渐下降。Alshweki等[13]收集了中重度HIE新生儿亚低温治疗期间的血液和尿液样本，并根据住院期间神经系统检查结果分为预后良好组(n＝13)及预后不良组(n＝18)。结果显示亚低温治疗期间所有新生儿血液和尿液S100B的水平均逐渐下降，其中预后不良组尿液S100B的浓度高于预后良好组，而血液S100B的浓度差异无统计学意义。其中，尿液S100B的浓度梯度下降主要集中于生后前2 d，这与S100B的半衰期较短有关。当第1天尿液S100B浓度为0.66 μg/L时，对不良结局的预测性最佳(AUC＝0.73，敏感性83%，特异性70%)。由此可见，尿液S100B的监测不仅有助于及时发现IVH及HIE等常见脑损伤，而且可用于早期评估窒息新生儿应用亚低温治疗的临床获益。唾液样本满足临床医生对于生物标志物易获取、可重复、简便无创的需求。Gazzolo等[3]收集了129例足月儿和97例早产儿的唾液，首次提出了健康足月儿生后6 h内唾液中S100B的浓度参考范围(5%~95%)为0.3~0.7 μg/L，无脑损伤早产儿[胎龄(33±2)周]唾液中S100B的浓度参考范围为0.15~2.6 μg/L。研究同时比较了部分新生儿外周血和唾液样本后发现两者S100B水平相当(唾液＝0.51 μg/L vs血液＝0.53 μg/L)。此外，一项国际多中心横断面研究动态监测了无窒息新生儿(对照组，n＝244)、12月龄脑发育正常的窒息新生儿(A组，n＝15)和脑发育异常的窒息新生儿(B组，n＝33)在生后96 h内的唾液S100B浓度后发现，B组生后首次采样的唾液中S100B浓度即较同胎龄健康新生儿升高24倍，在生后12 h内逐渐升高并持续24 h，而A组和对照组唾液S100B的水平在96 h内无明显变化；当生后即刻采样的唾液S100B的浓度较同胎龄对照组升高3倍时，对12月龄不良神经预后预测性最佳(AUC＝1，敏感度和特异度均为100%)[14]。唾液样本采样便捷且与血液浓度一致性较好，或可帮助临床医生早期识别高危窒息新生儿。NSE是糖酵解烯醇化酶的二聚体同工酶，主要位于神经元和神经内分泌细胞的细胞质中。研究表明，血液中的NSE不仅与心脏骤停、中风和创伤性脑损伤的不良预后有关，而且可作为神经内分泌肿瘤如小细胞肺癌和神经母细胞瘤的监测标志物[15]。脑细胞损伤后，脑脊液和血液中均可检测到异常升高的NSE，血液中的半衰期大约为24 h。新生儿NSE水平主要用于预测窒息新生儿脑损伤的严重程度及神经发育结局。研究发现，中重度HIE新生儿(n＝82)脐血NSE浓度远高于健康新生儿(n＝80)的脐血NSE浓度，分别为52.97 μg/L和28.7 μg/L，以34.7 μg/L为临界值预测中重度HIE时敏感性及特异性均可达100%[16]。脐血NSE或可作为中重度HIE的良好预测指标，但与远期神经发育的关系有待进一步研究。与外周血S100B相似，生后第1天的外周血NSE水平即可很好地预测中重度NE的发生(临界值38.8 μg/L，敏感度100%，特异度95.2%)[2]。Huang等[17]比较了HIE新生儿生后外周血NSE水平、aEEG和MRI与18月龄时神经预后之间的关联性后发现，生后第3天外周血NSE浓度偏高与中重度发育迟缓有关，并且以27.3 μg/L作为临界值时对于生后发育迟缓的预测效能优于aEEG和MRI(NSE：敏感性100%，特异性87.50%；aEEG：敏感性100%，特异性25%；MRI：敏感性94.44%，特异性71.88%)。亚低温治疗同样可影响外周血NSE水平。Yang和Li[18]筛选了92例中重度HIE新生儿(常规治疗组n＝30，48 h组n＝29，72 h组n＝33)和30例健康对照新生儿，比较亚低温治疗时长对于HIE新生儿外周血NSE浓度的影响，研究显示HIE新生儿生后第1天外周血NSE水平明显升高，于日龄第7天降至健康对照组相似水平，而亚低温治疗可加快外周血NSE水平下降的速度，以亚低温治疗72 h组尤为显著。但Catherine等[7]研究同步发现亚低温72 h后外周血NSE水平未见进一步下降。值得注意的是，标本溶血可显著影响外周血NSE的检测结果，每增加10 mg/L的游离血红蛋白可相应增加约0.29 μg/L的NSE[19]。综上，外周血NSE也许能成为窒息新生儿脑损伤的特异性生物标志物，但因NSE半衰期较长及脑损伤严重程度不同，各研究论证的预测时间点存在一定差异。此外，亚低温治疗对于外周血NSE水平的影响目前尚未定论。窒息新生儿日龄第4天时脑脊液中NSE浓度升高与NE严重程度及早期死亡有关，并且亚低温治疗可造成脑脊液中NSE水平下降，与良好脑发育预后有关[10]。León-Lozano等[20]收集了43例HIE新生儿生后12~72 h的脑脊液样本，并与59例疑似感染的足月儿脑脊液比较后发现，HIE组脑脊液NSE水平较对照组明显升高，重度HIE新生儿脑脊液NSE浓度可高达220.5 μg/L，而对照组平均约10.6 μg/L；脑脊液中高浓度NSE与异常aEEG及MRI评分相关，以108 μg/L为临界值预测不良预后(死亡、脑瘫、24月龄神经发育障碍)的诊断效能最佳。因此，脑脊液中NSE浓度或可用来评估HIE的严重程度及神经结局，但因标本采集具有一定创伤性，临床运用受到限制。GFAP是一种星形胶质细胞来源的细胞骨架中间丝蛋白，相对分子质量为40 000~53 000。当星形胶质细胞受损时，GFAP被释放到脑脊液中，透过血脑屏障继而在外周血中被检测到，血液中的半衰期约为24~48 h，常被视为脑损伤和帕金森等神经系统退行性疾病的指标[21]。Zaigham等[22]检测了15例HIE新生儿和31例健康新生儿的脐血样本后发现两组脐血GFAP水平差异并无统计学意义。目前脐血GFAP作为窒息新生儿脑损伤的预测指标有待考证。Yang等[23]对比了40例NE新生儿和39例健康对照新生儿生后96 h的外周血GFAP水平后发现，96 h内NE新生儿外周血GFAP水平均显著高于健康对照组，其中日龄12 h的GFAP浓度对于18~24月龄时的认知评分(AUC＝0.72)和语言评分(AUC＝0.74)预测性最佳。但在罹患IVH或PVL的早产儿(胎龄<34周)研究中显示，生后3 d内外周血GFAP浓度与健康对照组无显著差异[24]。虽然GFAP在外伤性脑损伤中应用广泛，但其与新生儿脑损伤之间的关系，因相关研究的目标人群及脑损伤类型缺乏一致性，尚未得到肯定结论。与S100B和NSE类似，PVHD早产儿脑脊液中GFAP浓度可高达24.85 μg/L，这与脑实质病变程度、12月龄神经发育异常和死亡有关[8]。足月窒息新生儿日龄第4天的脑脊液GFAP浓度也显著高于脑发育正常的对照组，NE新生儿脑脊液GFAP水平与脑损伤严重程度和早期死亡有关[9]。代谢产物可以从病理生理机制角度反映脑部缺血缺氧状态下生化代谢的变化，为预测或量化缺血缺氧损伤的严重程度提供潜在的生物标志物。脐血氨基酸及酰基肉碱的代谢特征与新生儿早期缺血缺氧状态有关[25]。脐血代谢物中的乳酸和丙氨酸结合Apgar评分对HIE预测性良好(敏感度96.15%，特异度100%，AUC＝0.96)[26]。Ahearne等[27]发现脐血中琥珀酸、甘油、3-羟基丁酸和O-磷酸胆碱的代谢指数与窒息足月儿早期死亡相关，其对死亡/脑瘫结局的预测性(AUC＝0.92)优于pH值、乳酸和碱剩余等常规生化指标，但仍逊色于aEEG(AUC＝0.96)及Sarnat评分(AUC＝0.98)。血浆代谢谱能全面反映缺氧缺血损伤下全身代谢紊乱的情况。与健康对照相比，HIE新生儿外周血中异常的代谢产物大部分与氨基酸代谢、能量代谢、神经递质合成、嘧啶代谢和氧化调节相关，并且逻辑回归分析显示丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苹果酸、丁二酸、丙酮酸和牛磺酸等均表现出良好的预测性能(AUC>0.95，敏感性和特异性均>0.85)，其中α-酮戊二酸可用于区分HIE严重程度[28]。Friedes等[29]发现NE新生儿的外周血中有20余种氨基酸等代谢物存在异常，其中C6糖胺和瓜氨酸的浓度在中重度NE新生儿中显著升高，组氨酸和C6糖胺与Bayley-Ⅲ认知、运动和语言显著相关，甜菜碱与Bayley-Ⅲ认知、运动和综合评分显著相关；在基于Sarnat评分的回归模型中添加组氨酸、C6糖胺和甜菜碱可显著改善该模型拟合Bayley-Ⅲ评分的情况。血浆中某些代谢物的水平可作为早期快速诊断HIE的生物标志物。新生儿HIE及其严重程度可影响尿液代谢谱特征，早期死亡病例的尿液中乳酸排泄显著增加[30]。早产儿生后第2天及第10天尿液代谢产物与校正足月胎龄时异常大脑MRI评分有关，异常代谢产物涵盖乳酸、醋酸盐等涉及能量代谢通路的物质[31]。此外，尿液代谢组学对于IVH的发生同样有一定预示作用，研究显示生后第1天尿液代谢指标对于IVH预测性最强，代谢产物主要定位于能量代谢通路，如糖酵解及无氧代谢的丙酮酸和乳酸等[32]。综上，尿液代谢组学可作为一种潜在的、非侵入性的脑损伤生物标志物，但缺乏量化数据。新生儿脑损伤的诊断需根据出生史、临床表现、颅脑超声及MRI等因素综合判断，但是现有临床检测手段不仅敏感性一般，而且存在明显的滞后性。S100B、NSE和GFAP等代谢产物相关生物标志物的研究不仅能为临床工作提供具有高敏感性和特异性的检测方法，而且有助于加深对脑损伤病理生理学的理解。然而目前有关脑损伤的生物标志物主要以新生儿脑损伤如NE为主，早产儿方面的研究较少，并且存在单中心、样本量少、缺乏临界值等方面的不足，仍需要大量多中心的临床研究在疾病种类、取样时间及浓度阈值方面得出可靠结论。
