探讨miRNA-20a在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的A549细胞焦亡与炎症反应中的作用与调控机制。培养人肺泡上皮A549细胞，以LPS为刺激物建立细胞焦亡及炎症反应模型，给予LPS+三磷酸腺苷刺激为LPS组，未给予刺激为空白对照组，验证模型是否成功。将A549细胞根据转染物质分为miRNA-20a模拟物（mimics）组、mimics-阴性对照（negative control，NC）组、miRNA-20a抑制物（inhibitor）组和inhibitor-NC组，构建过表达及沉默miRNA-20a的A549细胞模型，各组细胞在转染24 h后给予LPS+三磷酸腺苷刺激。构建TLR4-3'UTR双荧光素酶报告基因载体质粒，包括野生型（WT）载体质粒TLR4-3'UTR-WT1、TLR4-3'UTR-WT2及相应的变异型（MUT）载体质粒TLR4-3'UTR-MUT1、TLR4-3'UTR-MUT2，用双荧光素酶报告基因实验验证miRNA-20a的靶基因。采用实时荧光定量聚合酶链反应、免疫印迹试验及酶联免疫吸附试验检测各组焦亡标志因子消皮素D（gsdermin D，GSDMD），炎症因子凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1）、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β），以及信号分子Toll样受体4（Toll-like receptor-4，TLR4）、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）mRNA及蛋白表达。免疫荧光检测各组细胞TLR4表达和NF-κB入核情况。LPS组A549细胞GSDMD、ASC、NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA和蛋白表达量均高于空白对照组（P<0.05），模型建立成功。mimics组miRNA-20a表达量高于mimic-NC组（P<0.05），inhibitor组miRNA-20a表达量低于inhibitor-NC组（P<0.01）。双荧光素酶报告基因实验显示，TLR4-3'UTR-WT与miRNA-20a mimics共转染组的相对荧光值低于TLR4-3'UTR-WT与mimics-NC共转染组（P<0.05）。mimics组LPS介导的A549细胞GSDMD、ASC、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表达水平均低于mimics-NC 组（P<0.05），inhibitor 组GSDMD、ASC、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表达水平均高于inhibitor-NC 组（P<0.05）。在LPS诱导的A549细胞焦亡及炎症反应中，miRNA-20a可能经TLR4/NF-κB 信号通路对细胞焦亡及炎症反应产生抑制作用。新生儿急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是新生儿临床常见的危重症之一，病死率高达30%~50%［1, 2］，目前普遍认为炎症反应失控是其发生发展的重要环节。焦亡由消皮素D（gsdermin D，GSDMD）蛋白触发，造成细胞破裂、胞质内容物释放，诱发炎症反应［3, 4］。有研究表明与细胞焦亡有关的NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein，NLRP）1、NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1）等炎症因子与ARDS的发生有很大关系［5, 6］。miRNA-20a是本课题组前期利用基因芯片技术从新生儿ARDS患儿外周血筛选出的一条表达下调的微小RNA（microRNAs，miRNAs），生物信息学分析预测Toll样受体4（Toll-like receptor-4，TLR4）为其潜在靶基因。有研究证实miRNA可通过调控TLR4抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的急性肺损伤大鼠肺组织炎症反应和细胞焦亡［7］。因此，我们推测miRNA-20a可能通过TLR4/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路调控新生儿ARDS的发病过程。A549细胞具有肺泡Ⅱ型上皮细胞相关表型和特征，是研究肺泡上皮细胞结构和功能的重要替代细胞系。LPS和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）是非经典细胞焦亡途径中的重要分子［8, 9, 10］，国内外研究常用LPS联合ATP刺激构建细胞焦亡模型。为探讨miRNA-20a在新生儿ARDS炎症反应及细胞焦亡中的作用与机制，本文采用LPS联合ATP刺激A549细胞建立细胞焦亡及炎症反应模型，将miRNA-20a模拟物（mimics）和抑制物（inhibitor）转染进入细胞，验证miRNA-20a的功能，从细胞学层次揭示其调控LPS诱导的A549细胞焦亡及炎症反应的规律，为新生儿ARDS发病机制的研究提供实验依据。
一、主要材料及试剂
1.实验细胞：人肺泡上皮细胞株A549，中国科学院上海细胞库提供。
2.主要试剂：DMEM培养基、磷酸缓冲盐溶液（phoshpate buffer solution，PBS）、胎牛血清、0.25%乙二胺四乙酸胰酶、青链霉素双抗（Gibco，美国）；LPS O55：B1、ATP（sigma，美国）；miR-20a mimics、mimics阴性对照（negative control，NC）、miRNA-20a inhibitor及inhibitor NC（锐博，中国）；miRNA转染试剂（锐博，中国）；Lipotectamin®2000转染试剂（Invitrogen，美国）；Trizol（TAKARA，日本）；miRNA逆转录试剂盒（诺唯赞，中国）；SYBR实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）试剂盒（诺唯赞，中国）；RIPA裂解液（碧云天，中国）；脱脂奶粉（BD公司，美国）；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜；兔抗人NLRP3一抗（博奥森，中国）；兔抗人Caspase-1/p20/p10、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）、GSDMD、GAPDH一抗（Proteintech，中国）；β-actin抗体（赛维尔，中国）；NF-κB p65抗体（CST，美国），辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体（Bioworld，中国）；双荧光素酶报告实验试剂盒（碧云天，中国）；异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的荧光二抗（Bioworld，中国）；白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（BOSTER，中国）；野生型（WT）和变异型（MUT）TLR4-3'UTR双荧光素酶报告基因载体质粒（锐博，中国）。各引物的设计及合成均由南京锐博有限公司及上海捷瑞生物工程有限公司联合完成。
二、实验方法
1.A549细胞培养：A549细胞培养于含10％胎牛血清和100 U/ml青链霉素混合液的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，根据细胞生长状况，1~2 d换液1次，2~3 d传代1次。
2.构建A549细胞焦亡模型与分组：将培养的A549细胞分为LPS组和空白对照组。LPS组加LPS（1 mg/L）刺激8 h，并在收集细胞沉淀前0.5 h加入ATP（5 mmol/L），空白对照组则加入PBS。收集各组细胞沉淀及细胞上清，细胞沉淀用于提取各组细胞总RNA和胞浆蛋白，通过qPCR扩增检测各组GSDMD、ASC、NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相对变化，胞浆蛋白用于免疫印迹实验（Western Blot，WB）检测各组细胞GSDMD、ASC、NLRP3、Caspase-1蛋白表达，细胞上清用于ELISA法检测各组IL-1β蛋白表达情况，验证模型构建是否成功。
3.细胞转染及实验分组：将培养的A549细胞分为miRNA-20a模拟物（mimics）组、模拟物阴性对照（mimics-NC）组、抑制物（inhibitor）组、抑制物阴性对照（inhibitor-NC）组，分别转染miRNA-20a mimics、mimics-NC、inhibitor和inhibitor-NC，24 h后收集细胞沉淀用于后续检测各组miRNA-20a的mRNA和蛋白表达量，验证细胞转染效率，从而构建过表达及沉默miRNA-20a的A549细胞模型。各组细胞在转染24 h后以1 mg/L LPS刺激8 h，在收集细胞前0.5 h加入 ATP（5 mmol/L），收集细胞沉淀及上清，采用qPCR 检测各组GSDMD、ASC、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、TLR4、NF-κB mRNA表达，WB检测各组GSDMD、ASC、NLRP3、Caspase-1蛋白表达。免疫荧光试验检测各组细胞中TLR4、NF-κB的表达。细胞上清用于ELISA检测各组IL-1β表达情况。
4.靶基因预测及双荧光素酶报告基因试验：使用Target Scan、PicTar和miRanda软件预测发现TLR4为miRNA-20a可能的靶基因。借助Target Scan生物信息学软件，预测miRNA-20a 与 TLR4 可能有2个结合区域，根据结合区序列，构建2个结合序列对应的野生型（WT）TLR4-3'UTR双荧光素酶报告基因载体质粒TLR4-3'UTR-WT1、TLR4-3'UTR-WT2及相应的变异型（MUT）载体质粒TLR4-3'UTR-MUT1、TLR4-3'UTR-MUT2。用Lipotectamin®2000将含有WT或MUT的TLR4-3'UTR双荧光素酶报告基因载体质粒分别与mimics-NC、miRNA-20a mimics共转染到A549细胞中，分成4个实验组。转染4~6 h后更换新鲜培养基，转染48 h后收集细胞沉淀，用于后续检测荧光值，以验证miRNA-20a与TLR4的靶向关系。对2个结合区域分开验证。
三、检测指标及方法
1.各指标mRNA表达量检测：采用qPCR方法检测各组GSDMD、ASC、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、TLR4、NF-κB mRNA表达量。收集各组细胞，Trizol法提取细胞总RNA，参照逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，以GAPDH为对照，通过SYBR实时荧光定量试剂盒进行扩增反应，计算各组GSDMD、ASC、Caspase-1、IL-1β、NLRP3、TLR4、NF-κB表达量。因miRNA的特殊性，设计一个具有颈环结构的反转录引物，将其反转录成cDNA，miRNA-20a的序列为UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG，以U6为对照，检测miRNA-20a表达量，验证转染效率。
2.各指标蛋白表达量检测：采用WB检测各组GSDMD、ASC、Caspase-1、NLRP3蛋白表达量。应用RIPA裂解液提取细胞内总蛋白，进行SDS-PAGS垂直凝胶电泳分离蛋白、将蛋白转移至PVDF膜、膜封闭，分别孵育对应抗体GSDMD（1∶1 000）、NLRP3（1∶1 000）、Caspase-1/P20/P10（1∶1 000）、ASC（1∶1 000），孵育相应二抗（1∶5 000）后借助化学发光凝胶成像系统，通过ECL显影剂曝光观察蛋白条带，以GAPDH/β-actin作为内参。
3.miRNA-20a靶基因验证：采用双荧光素酶报告基因试验检测荧光素酶活性相对变化验证miRNA-20a与TLR4的靶向关系。配置Luciferase底物和Stop Regent底物，取出待检测的培养板，吸去培养基，用PBS清洗2次后，加入250 μl/孔1X PLB裂解液，室温裂解15 min后12 000转/min离心10 min。吸取上清10 μl加入不透明酶标板，借助 GloMax仪器测定萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的荧光值，以二者比值作为分析指标。
4.各组细胞TLR4和NF-κB 表达检测：采用免疫荧光试验检测各组细胞中TLR4、NF-κB的表达。取出待测的培养板，弃去培养基，PBS清洗，按免疫荧光试验操作步骤处理后加入 3% BSA室温封闭1 h；弃去封闭液，分别滴加兔抗人NF-κB p65（1∶200）、兔抗人IL-1β（1∶200），4℃孵育过夜；PBS 漂洗后滴加 FITC标记的荧光二抗，室温避光孵育 1 h；PBS 洗涤后滴加 DAPI复染5 min；PBS洗涤后甘油封片并在荧光显微镜下观察。
5.各组细胞上清液IL-1β表达检测：采用ELISA法，根据试剂盒说明书的检测步骤，检测各组A549细胞上清液中IL-1β的表达量。
四、统计学方法
应用Prism统计软件进行数据分析。正态分布的计量资料以均值±标准差表示，两组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
一、LPS刺激对A549细胞焦亡标志因子及炎症因子表达的影响
LPS组A549细胞GSDMD、ASC、NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表达量和蛋白表达量均高于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1、图1。LPS组A549细胞上清液IL-1β表达量高于空白对照组［（5.41±0.71）比（3.29±0.23）］，差异有统计学意义（P<0.05）。LPS诱导A549细胞炎症反应及焦亡模型成功建立。
二、miRNA-20a模拟物和抑制物转染A549细胞情况
mimics组miRNA-20a mRNA表达量高于mimics-NC组［（767.28±358.02）比（1.14±0.76）］，差异有统计学意义（P<0.05）；inhibitor组miRNA-20a mRNA表达量低于inhibitor-NC组［（0.61±0.10）比（1.00±0.09）］，差异有统计学意义（P<0.01）。表明成功构建沉默miRNA-20a的A549细胞株。
三、miRNA-20a的靶基因验证
1.miRNA-20a与TLR4的靶向关系：TLR4-3'UTR-WT1与mimics共转染组相对荧光值低于TLR4-3'UTR-WT1与mimics-NC共转染组［（0.77±0.08）比（1.23±0.16）］，差异有统计学意义（P<0.05）；TLR4-3'UTR-WT2与mimics 共转染组相对荧光值低于TLR4-3'UTR-WT2与mimics-NC共转染组［（0.31±0.25）比（1.32±0.10）］，差异有统计学意义（P<0.01）。TLR4-3'UTR-MUT1、TLR4-3'UTR-MUT2与mimics共转染组，同其与mimics-NC共转染组相对荧光值比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。
2.过表达及沉默miRNA-20a的A549细胞TLR4表达：mimics组TLR4 mRNA表达量低于mimics-NC组［（0.43±0.06）比（1.00±0.10）］，差异有统计学意义（P<0.001）；inhibitor 组TLR4 mRNA表达量高于inhibitor-NC 组［（1.54±0.17）比（1.16±0.11）］，差异有统计学意义（P<0.05）。mimics组A549 细胞TLR4蛋白表达少于 mimics-NC 组，inhibitor 组多于inhibitor-NC 组，见图2。
3.过表达及沉默miRNA-20a的A549细胞 NF-κB表达：mimics组NF-κB mRNA表达低于mimics-NC组［（0.56±0.19）比（1.03±0.16）］，差异有统计学意义（P<0.05）；inhibitor组NF-κB mRNA表达高于inhibitor-NC组［（1.48±0.20）比（1.01±0.07）］，差异有统计学意义（P<0.01）。mimics组 A549细胞核内 NF-κB 表达少于 mimics-NC组，inhibitor 组多于 inhibitor-NC 组，见图3。
四、过表达及沉默miRNA-20a对LPS介导A549细胞炎症反应及焦亡的调控机制1.过表达miRNA-20a对LPS介导A549细胞焦亡标志因子及炎症因子表达的影响：mimics组A549细胞GSDMD、ASC、Caspase-1、IL-1β、NLRP3 mRNA表达量和蛋白表达量低于mimics-NC 组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2、图4。mimics组A549细胞上清液中IL-1β表达量低于mimics-NC组［（2.82±0.46）比（3.57±0.55）］，差异有统计学意义（P<0.05）。2. 沉默miRNA-20a对LPS介导A549细胞焦亡因子及炎症因子表达的影响：inhibitor组A549细胞GSDMD、ASC、Caspase-1、IL-1β、NLRP3 mRNA表达量和蛋白表达量高于inhibitor-NC 组，差异有统计学意义（P<0.05），见表3、图5。inhibitor组A549细胞上清液中IL-1β表达量高于inhibitor-NC 组［（5.07±1.06）比（3..59±0.44）］，差异有统计学意义（P<0.05）。ARDS是新生儿常见危重症之一，发病机制目前尚未被完全阐明，但普遍认为肺部过度失控的炎症反应是发病的关键环节，因此，抑制炎症发生可能是其潜在的治疗手段。细胞焦亡是近年来受到广泛关注的一种新型程序性细胞死亡，其形态学特征、发生及调控机制均不同于凋亡、自噬、坏死等其他细胞死亡方式。细胞焦亡是由GSDMD介导、伴随质膜破裂、细胞肿胀及渗透溶解，并促进大量炎性介质如IL-1β、IL-18等释放，进而启动炎症反应的过程。在人体和小鼠体内，细胞受到不同刺激时会通过不同信号通路启动焦亡程序，目前研究较多的为经典焦亡途径和非经典焦亡途径［11, 12］。经典焦亡途径指病原微生物刺激机体后，Caspase-1前体活化为Caspase-1切割GSDMD，诱导细胞膜穿孔使细胞溶解、死亡，促进IL-1β前体和IL-18前体成熟，使胞内物质外释从而扩大炎症反应；非经典焦亡途径指由LPS刺激细胞后，活化Caspase-4/5/11前体对GSDMD进行有效切割，使之分为GSDMD-NT和GSDMD-CT，而GSDMD-NT转移到细胞膜上形成活性孔隙，水分子等物质通过孔隙进入细胞，引起细胞肿胀及裂解，最终导致机体炎症反应。诸多研究表明细胞焦亡广泛地参与多种疾病的发生发展，但目前国内有关细胞焦亡与ARDS的研究极少［13, 14, 15, 16］。本研究用LPS+ATP刺激人肺泡上皮A549细胞，采用qPCR、WB和ELISA等方法检测细胞沉淀中细胞焦亡标志因子GSDMD及炎症因子ASC、NLRP3、Caspase-1、IL-1β的mRNA和蛋白表达量，结果显示LPS组各项指标较空白对照组明显增高，证实LPS+ATP可成功诱导A549细胞炎症反应及焦亡，与Yang等［7］研究一致。miRNAs是非编码的单链小RNA，可在多种组织和细胞中表达，在机体各种生理病理过程中发挥重要作用。目前，已有研究证实miRNAs参与ARDS的发病过程［7，17, 18, 19］。miRNA-20a是miR-17家族之一，本课题组前期利用基因芯片技术对ARDS新生儿和健康新生儿外周血miRNAs表达谱进行高通量筛选，结果提示ARDS新生儿miRNA-20a表达量明显下调；对miRNA-20a进行功能验证，结果显示miRNA-20a可调控LPS诱导的A549细胞炎症反应［20］。因此，miRNA-20a在ARDS的炎症发生中可能发挥一定作用。本实验在前期研究的基础上，用miRNA-20a mimics及inhibitor转染A549细胞，qPCR检测细胞中miRNA-20a表达量，结果显示miRNA-20a mimics组较mimic-NC组miRNA-20a表达量明显增高，miRNA-20a inhibitor组较inhibitor-NC组表达量明显下降，提示过表达及沉默miRNA-20a模型构建成功。为了进一步研究miRNA-20a的具体调控机制，本课题组利用生物信息学软件分析，结果显示TLR4与miRNA-20a存在相互作用区域，预测TLR4可能为miRNA-20a的下游靶基因。本研究进一步通过构建TLR4-3'UTR双荧光素酶报告基因载体质粒，将miRNA-20a mimics与该质粒共转染A549细胞，结果显示TLR4-3'UTR-WT与miRNA-20a mimics 共转染组的相对荧光值较其与mimics-NC共转染组明显下降；通过检测过表达及沉默miRNA-20a的A549细胞中TLR4的表达量，结果显示过表达miRNA-20a时TLR4表达降低，沉默miRNA-20a时TLR4表达增高，结合双荧光素酶报告基因实验结果，证实TLR4是miRNA-20a的下游靶基因，miRNA-20a对TLR4具有直接调控作用。TLR4/NF-κB为炎症反应中广泛存在的信号通路之一，多种研究证实该通路广泛参与疾病的发生发展。因此，miRNA-20a可能通过TLR4/NF-κB信号通路对新生儿ARDS炎症反应进行调控。本实验利用PCR、免疫荧光等技术检测过表达及沉默miRNA-20a后TLR4下游NF-κB的磷酸化情况，结果显示过表达miRNA-20a时NF-κB表达降低，沉默miRNA-20a时NF-κB表达增高，证实miRNA-20a对TLR4/NF-κB信号通路具有调控作用。为进一步明确miRNA-20a经对TLR4/NF-κB信号通路对炎症反应的调控作用及机制，我们将miRNA-20a mimics及inhibitor转染A549细胞24 h后应用LPS 8 h+ATP 0.5 h刺激A549细胞，结果显示过表达miRNA-20a的A549细胞中细胞焦亡标志因子GSDMD以及炎症因子ASC、NLRP3、Caspase-1、IL-1β的mRNA和蛋白表达降低；沉默miRNA-20a的A549细胞中上述指标表达增加。研究结果证实miRNA-20a对LPS诱导的A549细胞焦亡及炎症反应具有抑制作用，可能是通过TLR4/NF-κB信号通路发挥调控作用。综上所述，结合目前实验结果得出以下结论，即miRNA-20a可能靶向调控TLR4，经TLR4/NF-κB信号通路抑制LPS诱导的A549细胞焦亡和炎症反应，对肺泡上皮细胞具有保护作用，进而阻止急性肺损伤的发生发展。引用本文: 陶慧娴, 王木子, 郭艳, 等. miRNA-20a在脂多糖诱导A549细胞焦亡和炎症反应中的作用与机制研究 [J] . 中华新生儿科杂志（中英文）, 2023, 38(2) : 107-114. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2096-2932.2023.02.009.
