胎儿基因诊断可指导临床治疗，并为新生儿健康的精准医疗筛查建立基础。虽然无创产前检测（noninvasive prenatal testing, NIPT）通过检测非整倍体及与产前诊断相关的少量变异，使得胎儿筛查发生巨大改变，但全面基因检测仍需要羊膜腔穿刺等有创操作。2023年11月23日，来自马萨诸塞州总医院、布莱根妇女医院、麻省理工学院以及哈佛大学布罗德研究所的研究人员在《The New England Journal of Medicine》杂志上发表了题为“High-Resolution and Noninvasive Fetal Exome Screening”的文章，报道了一种有可能广泛应用的高分辨率无创产前基因筛查方法，称之为无创胎儿测序（noninvasive fetal screening, NIFS)。在该篇文章中，研究者们通过分析51名孕妇的血液样本对NIFS方法进行评估，表明NIFS能够捕获遗传自母体的基因突变，以及母体中不存在的与产前诊断相关的新发突变。该方法可以通过母体血液循环中的游离DNA（cell free DNA, cfDNA）筛查胎儿整个外显子组，以检测胎儿DNA序列的所有基因变异，并区分潜在的致病性变异与遗传自母体的可能良性变异。

活产婴儿中出生缺陷的发病率约为5%，其中约20%可归因于可识别的遗传疾病。有超过8600种疾病具有已知或怀疑的潜在遗传病因，其中大多数没有有效的治疗方法^[1]。近年来，在全球范围内无创产前检测（noninvasive prenatal testing, NIPT）被开发和实施以筛查常见的胎儿染色体非整倍体和微缺失/微重复综合征^[2]。NIPT是基于母体血液循环中含有母体和胎儿的cfDNA进行检测。胎儿cfDNA被认为来源于胎盘滋养细胞的凋亡，然后进入母体循环。胎儿cfDNA仅占母体血浆总cfDNA的一小部分，在妊娠中期约为10%，在妊娠早期更低，这为临床进行NIPS带来了一定挑战。此外，研究表明胎儿游离DNA（cell free DNA, cfDNA）可用于筛查或诊断常见的单基因疾病^[3]。目前研究人员已开发了一种可同时筛查染色体和单基因疾病的综合NIPT以检测大量遗传出生缺陷，但此方法可检测的单基因疾病类型依然有限^[1]。外显子组筛查仍需要通过侵入性手段进行基因检测，如羊膜腔穿刺术，这涉及到巨大的成本，并为母亲和胎儿带来一些固有的风险，限制了许多单基因疾病的诊断^[4,5]。

该研究开发了一种非侵入性高分辨率产前基因筛查方法，称为无创胎儿测序（non-invasive fetal sequencing, NIFS), 此方法基于孕妇血液循环中的cfDNA通过全外显子组探针杂交捕获以筛查胎儿全外显子组，检测胎儿DNA序列的所有基因突变。NIFS在发现单核苷酸变异（SNV），尤其是新发SNV和父系遗传SNV方面非常灵敏（灵敏度的中位数，96.3%）。这一结果在不同的胎儿分数（fetal fraction, FF，即胎盘或胎儿来源的cfDNA占总cfDNA的比例）情况下都非常稳健（灵敏度，92.6%-97.1%；阳性预测值，87.9%-92.2%）。总体而言，胎儿SNV基因型能够以相对较高的灵敏度与母体基因型区分，但当母体基因型是杂合子时，准确度则会在FF较低时降低（65.6%-93.2%）。对于插入或缺失（indel），其在NIFS和标准外显子组测序中的错误发现率均高于SNV，发现检测到新发indel和父系遗传indel的灵敏度中位数为81.9%（范围：66.4%-84.6%），而对于母系杂合遗传变异，灵敏度中位数为71.3%（范围：51.7%-77.8%)。

在该项研究中，研究人员比较了在11个胎儿和28名母亲的NIFS中发现的变异与通过匹配胚系外显子组测序发现的变异。在对照胚系外显子组测序进行过滤之前，NIFS检测SNV的灵敏度为99.7%，检测indel的灵敏度为93.9%，这一结果提示，随着这些方法的进一步发展，有可能达到更高的灵敏度。由于该队列中大片段拷贝数变异（CNV）数量较少，因此无法对这一变异类型进行基准测试。研究人员还发现，在28名母亲的582,839个经胚系外显子组测序确认的变异中，NIFS能够对母体变异进行高灵敏度基因分型（灵敏度为98.3%），这一结果突显了将该方法用于携带者筛查的潜力。

图1 通过高分辨率无创产前检测方法（NIFS）进行无创胎儿外显子组筛查的工作流程

A. 从母体血浆提取cfDNA，随后进行外显子组捕获，并计算FF；
B. 在考虑FF的基础上开发检测新发变异的方法，根据母体和胎儿基因型组合显示每个位点上相应特定等位基因比例。每个簇代表一个特定母体-胎儿基因型组合；
C. 在被转诊接受有创检测的14名孕妇中进行NIFS原理验证应用，以及临床关注的代表性变异。

研究人员进一步通过分析51名孕妇血液样本评估了NIFS方法的可行性，这些孕妇在入组参与者的医院具有代表性。孕妇孕龄涵盖妊娠早、中、晚期，其中5名孕妇处于妊娠早期，9名处于妊娠中期，37名处于妊娠晚期。FF为6%-51%。研究人员捕获并测序了22,995个基因，平均覆盖度为210×。并利用基于机器学习的方法（通过FF和cfDNA的其他序列特征进行建模）发现SNV和indel，并探索了CNV的read-depth谱。

研究人员还在被转诊接受标准诊断检查的14名孕妇中评估了NIFS的实用性，结果显示NIFS可以检测出有创检测所发现的全部变异(6/6，100%)，包括：一个多发性畸形胎儿的一处新发CNV(NC_000007.14:g.155368937-159327017del)，一个小颌畸形胎儿的COL2A1中的一处剪接变异(NC_000012.12:g.47982610C→T)，以及与囊性纤维化相关的CFTR纯合p.Phe508del变异(NC_000007.14:g.117559592_117559594del)。应用该方法进行的携带者筛查在57.1%的母亲中检测出可报告变异，这一结果与标准筛查结果相似。所有样本性别均可准确推断，包括一些复杂病例，如一个女胎伴有一个消失的男胎，一名母亲曾接受过来自男性捐献者的干细胞移植。

研究人员基于胎儿非整倍体检测时常规采集的母体血浆样本中的cfDNA，利用全外显子组探针杂交捕获并通过二代测序技术，在核苷酸级分辨率下对各个胎龄胎儿的新发变异进行稳健筛查，并有可能在FF大于15%-20%时检测出母系遗传和隐性疾病变异。此外，该方法还可进行准确的携带者筛查，并检测出可报告的偶然发现（如BRCA2风险变异）。这项研究具有深远的临床意义，特别是对于超声检查怀疑胎儿异常并需要进行侵入性检查的妊娠。后续应该扩大和验证这些发现，并进一步开发NIFS方法。