中华医学会
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本文引用格式：王馨怡, 时春艳, 杨慧霞. 阴道微生物菌群与宫颈提前重构研究进展[J]. 中华围产医学杂志, 2024, 27(7): 588-594. DOI: 10.3760/cma.j.cn113903-20240304-00180.
摘要
早产是导致新生儿患病和5岁以内婴幼儿死亡的首要原因，对其内在病因和机制研究十分重要。早产是一个“多因一果”的综合征，由多个原因引起，病因可为子宫肌层、胎膜蜕膜和宫颈不同步激活，胎膜蜕膜及子宫肌层为起始的表型最终也表现为宫颈变短和变软。自人类微生物组计划开展以来，研究者对人体各个部位微生物群组成及其与健康的关系深入研究，其中阴道微生物菌
群及菌群失调与妊娠及病理妊娠研究得到一些进展。据此，本文对阴道微生物菌群与宫颈提前重构的关系及机制的最新研究进行综述，以探寻关于此方向待解决的问题和新的预防治疗手段。
【关键词】 阴道微生物菌群；宫颈重构；早产
早产在我国被定义为妊娠满28周、不满37周的分娩，是新生儿患病及小于5岁婴幼儿死亡的首要原因，可能造成新生儿呼吸窘迫、脑室内出血、坏死性小肠结肠炎，以及远期脑性瘫痪、认知功能障碍等严重后果［1］。目前，早产预防及治疗方法有限，近年发生率仍呈上升趋势，世界范围内为5%~18%［2］，故对早产病因及机制进行研究十分重要。
早产可分为自发性早产和医源性早产，本文主要探讨自发性早产的相关问题。自发性早产为多病因的综合征，病因包括遗传、激素功能不足、免疫状态、生殖器官结构异常、微生物及环境因素等。自发性早产病因可为子宫肌层、胎膜蜕膜和宫颈不同步激活，可引起不同临床表现/表型，如胎膜蜕膜首先激活的临床表现为阴道出血或早产胎膜早破、宫颈首先激活为宫颈机能不全样状态、子宫肌层首先激活为子宫提前收缩［3］，而无论是胎膜蜕膜激活还是子宫肌层激活最终均表现为宫颈缩短、扩张等改变，故也有学者提出宫颈变化为早产的初始步骤和主要事件［4］。
阴道微生物菌群失调为早产的病因之一，近年来有研究揭示了阴道微生物菌群与正常及病理妊娠的关系。故本文对阴道微生物菌群导致宫颈提前重构机制的进展进行综述，探究目前尚未解决问题，以期为后续研究找到方向。
一、宫颈结构及妊娠期间宫颈重构
宫颈主要由结缔组织构成，宫颈管内被覆柱状上皮，其分泌的黏液中含有防御因子，以及上皮细胞模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）、上皮细胞之间的紧密连接形成物理和免疫屏障［5］；另含有大量胶原纤维（约占90%），少量弹性纤维、糖胺聚糖（如透明质酸）及平滑肌细胞等。宫颈在孕期多保持一定硬度并呈紧闭状态，同时宫颈上皮增厚并产生黏液栓（含有许多防御因子）填充宫颈管，防止上行感染；正常情况下，临产后宫颈变短、消失、扩张，使得分娩顺利进行。
实际上，宫颈组织自早孕期开始变软，有研究利用超声、抽吸法等在非妊娠及妊娠期间进行纵向评估，均发现妊娠期宫颈硬度较非妊娠期明显下降，且妊娠早、中、晚期也呈下降趋势［6-7］。但因无法纵向取得人体妊娠期宫颈组织，所以组织和生化层面的认识大多来自于妊娠啮齿动物模型。
自妊娠开始至结束，宫颈经历软化、成熟、扩张及产后修复4个重叠的阶段，即宫颈重构。宫颈软化漫长且变化缓慢，此阶段宫颈的成熟胶原纤维逐渐被新合成的、含有未成熟交联的胶原纤维代替，后者直径较前者增加而抗拉扯能力下降。由于胶原纤维是决定宫颈硬度的主要因素，上述变化使得宫颈组织机械强度降低但此时结构仍完整，可保持闭合状态。接近临产时，宫颈快速成熟，此阶段胶原纤维溶解度增加且浓度下降、各种免疫细胞浸润，由于亲水性透明质酸、水通道蛋白含量增加以及核心蛋白聚糖下降，使得宫颈组织水分增加、胶原纤维对蛋白酶的亲和性增强而容易被水解，同时宫颈胶原纤维骨架分散且排列紊乱，最终宫颈组织完整性被破坏、变薄变软且顺应性明显增加，逐渐变短。而后在子宫收缩及重力作用下宫颈扩张，此阶段白细胞大量涌入宫颈组织，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）大量分泌，胶原纤维降解［8-9］。
综上，宫颈重构组织学特征主要为透明质酸增加、胶原纤维分散、炎性细胞浸润及水分增加。近期研究发现平滑肌细胞凋亡可能也是表现之一。宫颈重构受到内分泌因素（如促肾上腺激素释放激素、松弛素、雌激素、孕激素）、机械牵扯等诸多因素影响，其中胎儿下丘脑-垂体-肾上腺-胎盘轴的激活是诱发因素之一，而孕激素在宫颈局部作用的降低似乎更加重要［9-10］。而整个过程类似于炎症反应，涉及多种炎性细胞因子［如白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、IL-8、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）等］、免疫细胞（如中性粒细胞、巨噬细胞）及蛋白酶（主要是MMP）的作用，最终宫颈软度及顺应性增加而承受能力下降［11］。宫颈重构的可能机制如图1所示。
二、妊娠期阴道微生物菌群特点
阴道微生物菌群是阴道防御系统的重要部分，自人类微生物组计划展开以来，研究者利用测序技术对微生物组成进行深入研究。Ravel等［12］对无症状女性阴道菌群进行16s rRNA测序，并将其分为5个群落类型（community state type，CST），其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ型以乳酸杆菌为主，包括卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、惰性乳杆菌和詹氏乳杆菌，而Ⅳ型则由多样性菌群组成，主要为专性厌氧菌，如普雷沃菌、加德纳菌等。CSTⅣ型又被分为Ⅳ-A和Ⅳ-B两种类群，前者以嗜胃杆菌和普雷沃菌为主，Ⅳ-B则以阿托波菌属、加德纳菌以及其他与细菌性阴道病（bacterial vaginosis，BV）相关的分类群为主［13］。
研究显示，正常妊娠期间阴道微生物菌群以乳酸杆菌为优势菌，且与非孕期相比，其组成更加稳定，CST很少转变为Ⅳ型，这种稳定的状态可能与妊娠期间激素波动较小、无月经及宫颈阴道分泌物组成改变相关。除此之外，妊娠期阴道菌群多样性及丰富度均有所下降［14-16］，在分娩前多样性可能有所增加［17］。
三、阴道微生物菌群失调与宫颈提前重构
正常情况下，乳酸杆菌为优势菌是阴道环境健康的象征，其可通过产生乳酸降低阴道pH值、维持上皮屏障防止黏蛋白降解、产生过氧化氢抑制潜在病原体生长［18］、抑制MMP活性及影响炎症反应等机制起到保护作用［19-20］。菌群失调是指内在或外在因素引起的阴道微生物菌群向乳酸杆菌缺乏的变化。目前临床应用较多的阴道环境评价方法为阴道微生态评价体系及培养。阴道微生态评价指标中任意一项异常即可判断为阴道微生态失调，包括明确炎症如BV、外阴阴道假丝酵母菌病、需氧性阴道炎、混合阴道炎和菌群抑制或正常但功能异常者，以及部分目前无法判定、培养出的细菌导致的异常者［21］。
异常微生物菌群引起宿主反应，使得妊娠期宫颈提前重构即足月前出现宫颈变短、扩张等宫颈机能不全样改变［22］，以及宫颈物理屏障和化学屏障被破坏，病原体上行感染造成胎膜早破或宫内感染而导致宫缩，均可引起早产或妊娠丢失等不良结局［8］。
（一）阴道微生物菌群失调与宫颈提前重构相关
已有研究对阴道微生物菌群与短宫颈或宫颈管扩张的关系进行了探究。本团队临床实践中发现，孕中期出现无痛性宫颈缩短、内口开大的孕妇，同时合并阴道感染，经保守抗炎治疗后未出现早产胎膜早破及胎儿丢失等不良结局［23］。提示阴道微生物菌群异常可能是宫颈缩短的病因，但无法排除宫颈缩短后继发感染的可能。
Gerson等［24］证明CST Ⅳ型与孕中期短宫颈相关，但未明确因果关系。研究发现，短宫颈孕妇的阴道微生物菌群有一定特征，包括多样性增加而丰度降低，葡萄球菌、假单胞菌常见；詹氏乳杆菌和加德纳菌与短宫颈相关，而惰性乳杆菌及双歧杆菌与正常宫颈长度相关［25］。但目前对于惰性乳杆菌的作用仍有争议。在白种人中CST Ⅲ型可能是宫颈缩短（≤10 mm）的另一高危因素［26］。惰性乳杆菌在多数情况下与加德纳菌共存也可以从侧面说明CST Ⅲ型的负面影响［27］。宫颈机能不全孕妇的卷曲乳杆菌、惰性乳杆菌、格氏乳杆菌等乳酸菌属丰度较低，而加德纳菌、普雷沃菌丰度较高［28］。上述研究均提示阴道微生物菌群在发生短宫颈或宫颈管扩张之前即发生了变化。但不同研究关于短宫颈或宫颈管扩张的特征性CST及菌种结果不一致，可能是由于人种差异，但关于我国人群的研究欠缺且未能提示微生物菌群失调可预测宫颈变化的发生时间。
（二）阴道微生物菌群失调导致宫颈重构的机制
宫颈上皮细胞表达PRR，如Toll样受体1（Toll-like receptor 1，TLR1）、TLR2、TLR4、TLR3、TLR5、TLR6、TLR7、TLR9，以及细胞质病原体感应受体NOD样受体1 （NOD-like receptor 1，NLR1）、NOD2均在宫颈组织被发现［29］。病原体与PRR结合后可调节下游细胞因子释放及激活下游通路，引起宫颈上皮屏障被破坏、黏液成分改变及蛋白酶释放。宫颈上皮屏障被破坏可能是宫颈提前重构的关键和启动事件，且研究表明早产的发病始于宫颈阴道间隙，该间隙的上皮屏障可能对宫颈重构起到调节作用［30］。随着上皮屏障被破坏，病原体、水分、免疫细胞及炎性介质等进入宫颈间质，宫颈组织被破坏水解，使得宫颈组织成分重排，宫颈快速重构［31］。
1.宫颈上皮屏障被破坏：体外细胞实验及动物研究均发现，阴道微生物菌群失调可通过炎症、细胞死亡（凋亡、衰老）、上调微小RNA（microRNA，miRNA）、上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）等途径破坏宫颈上皮屏障。
阴道微生物菌群失调可引起宫颈细胞的炎症反应。Matsuda等［32］在体外实验中模拟加德纳菌感染宫颈细胞，发现其可促进炎性因子IL-1、TNF-α的分泌，进一步诱导弹力素表达，IL-8分泌增加，诱导中性粒细胞迁移并促进弹性蛋白酶分泌，同时对各种信号通路进行检测发现NLR信号通路及TNF、NF-κb通路表达上调。研究发现，阴道内加德纳菌也可通过TLR2/NF-κB诱导免疫激活［33］。研究发现，羞怯动弯杆菌可破坏上皮屏障，可能通过炎性介质上调诱导上皮屏障被破坏［34］。动物模型则为菌群对宫颈上皮屏障破坏的机制提供了更直接的证据。Sierra等［35］建立了加德纳菌阴道定植的孕鼠模型，并对宫颈阴道分泌物中的生物标志物进行检测，发现炎性因子IL-6、IL-8、IL-10和IL-1β水平升高，表明宫颈上皮屏障被破坏的标志物可溶性上皮钙黏蛋白明显增加，与宫颈成熟及扩张相关的基因Tff1表达增加；组织学方面发现定植组孕鼠黏蛋白表达增加，胶原纤维更加分散；生物力学方面宫颈组织抵抗外力变形的能力下降。上述研究证实加德纳菌阴道定植可能通过诱导局部炎症和破坏宫颈上皮屏障来促进宫颈重构并改变生物力学特征，从而导致早产。
既往关于EMT相关研究集中恶性肿瘤，在这一生物学过程中，上皮细胞经历多种变化后具有间质细胞表型，迁移、侵袭及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）合成能力均增强，底膜降解，细胞从起源上皮层迁移［36］。EMT在羊膜及宫颈组织中也同样被发现，炎症环境下宫颈上皮细胞发生EMT以重塑局部受影响区域；而在感染等因素暴露下，EMT不可逆而导致持续炎症和宫颈基质降解［37-38］。Tantengco等［39］在体外利用脂多糖诱导宫颈细胞，观察到EMT现象。Gordo和Mowa［40］对小鼠组织进行蛋白组学分析，发现妊娠及分娩期间宫颈间质标志物表达增加而上皮标志物表达减少，表明EMT与分娩期间宫颈变化相关。
miRNA是高度保守的非编码单链RNA，平均长度22个核苷酸，可通过碱基互补配对与靶mRNA非翻译区结合，对mRNA稳定性和翻译产生影响，起到抑制或激活翻译和调节转录作用。一种miRNA可调控多种mRNA，是转录后基因调控网络的关键分子［38，41］。近年来，miRNA在生理病理中的重要作用逐渐受到重视，多项研究已证实其与肿瘤、心血管疾病等多种疾病相关，可以被作为预测及治疗靶点［42-44］。miRNA在妊娠中的研究则处于起步阶段，特别是对自发性早产及宫颈重构的作用。Elovitz等［30］采集早产高危孕妇宫颈细胞进行检测，识别了与早产或短宫颈相关的宫颈miRNA谱，其中miRNA145和miRNA233均与黏附分子、细胞间连接蛋白的表达相关，从一定程度上说明miRNA参与了宫颈提前重构。后续研究在更大样本量人群中证实了前述结果，识别出的宫颈来源的多种miRNA与自发性早产相关，富集分析显示这些miRNA均参与了炎症通路的调节［45］。因此，研究者提出假设，炎症可能触发miRNA表达增强，导致黏附分子下调，引起宫颈上皮屏障被破坏。一项墨西哥人群的研究发现，宫颈分泌物中BV相关菌群如加德纳菌属、动弯杆菌属的增加与miRNA表达增强相关，且这些表达增强的miRNA 与细胞凋亡、巨噬细胞吞噬作用相关［46］。近年来体外宫颈细胞实验也说明了多种细菌与宫颈上皮细胞分泌miRNA、宫颈上皮屏障相关。而对于miRNA在阴道微生物菌群失调导致早产的作用机制研究较少，但在炎症相关研究中有所提示。Peng等［47］发现miR-199a-3p在早产患者的宫颈细胞中显著下调，体外宫颈细胞实验和脂多糖诱导小鼠模型中均被证实，其可以抑制宫颈上皮组织高迁移率族蛋白B1-TLR4/NF-κB信号通路表达，进而起到抗炎作用。
虽然体外细胞实验和动物模型均提示阴道微生物菌群对宫颈上皮屏障的破坏作用及机制，但由于体外细胞实验环境与体内不同，动物模型与人体组织仍有一定差异。Tantengco等［48］利用器官芯片进行探究，在脂多糖诱导宫颈上皮器官芯片中观察到宫颈上皮的凋亡、衰老及上皮间质迁移。而对于阴道微生物菌群失调相关的研究仍有待完善。
2.宫颈间质重排：微生物菌群与宫颈间质变化的研究集中于其诱导蛋白酶的产生，从而使得胶原蛋白骨架被降解及破坏。
Gerson等［49］在体外细胞实验中证实加德纳菌可诱导宫颈阴道上皮MMP-9上调。Willcockson等［50］对脂多糖诱导的早产小鼠进行研究，并对宫颈组织转录组进行分析，发现脂多糖可诱导宫颈组织炎性小体激活（脂多糖诱导独有），以及蛋白酶MMP13、MMP8及Ctsl（针对胶原蛋白及弹性纤维）转录上调，并且上皮下基质中的胶原纤维最先被破坏，故认为IL-1b可上调蛋白酶转录，靶向降解上皮下基质中的弹力纤维和胶原蛋白，最终导致宫颈组织提前重构并早产，为革兰阴性菌导致宫颈重构的机制提供了理论基础。
3.微生物-宿主相互作用：研究发现，非裔人群早产率较高，可能与阴道微生物菌群CST Ⅳ型比例较高有关［51］，但也有部分CST Ⅳ型孕妇未发生早产［52］。即使出现阴道微生物菌群失调，不良结局是否发生还取决于宿主对其识别和反应的差异，因此需要关注宿主反应及影响微生物菌群与宿主反应的因素如补体、代谢物等［53］。
研究发现，脂多糖诱导的C5aR缺陷小鼠最终未发生早产，也未出现宫颈重构的重要特点，即MMP和胶原纤维降解增加，提示C5a可诱导巨噬细胞、中性粒细胞释放炎性细胞因子及MMP，同时发现C3在早产中也起到重要作用［54-55］。Chan等［56］纵向采集妊娠期宫颈阴道间隙分泌物，并对阴道分泌物及免疫相关分子进行联合分析，发现CST Ⅲ型中宫颈缩短者IgM、C3b、C5和IL-6水平显著升高，故提出由补体反应介导的先天性和适应性免疫反应失调，是引起微生物驱动的宫颈重构、早产的原因，补体是驱动微生物-宿主不良相互作用的潜在关键分子。
随着代谢组学的发展，多项研究发现微生物可通过调节代谢物来影响宿主状态。这些代谢物可能由微生物与来源于宿主的物质（如细胞成分、食物、外源物质等）相互作用产生，故可以传递来自宿主、微生物群和环境的信息。代谢物已被发现在多种疾病中起着重要作用，尤其与肠道菌群相关的研究较成熟，如炎症性肠病患者患癌的易感性等［57］。由于遗传和饮食等因素，相同微生物群落的代谢组也不同，更加说明微生物产物对宿主反应的影响［58］。而阴道内代谢物研究处于起步阶段，Gerson等［59］发现孕中期短宫颈孕妇宫颈阴道脂质代谢物水平降低，早产孕妇鞘脂成分下调。Pruski等［60］发现早产孕妇阴道内短链脂肪酸水平增加，且认为脂质是代谢特征的核心部分，反映了阴道微生物群组成及炎症水平。此外，体外实验证实短链脂肪酸可增加宫颈上皮细胞分泌促炎细胞因子［61］，鞘脂也在信号传导、免疫调节中起着重要作用［62］。
四、微生物菌群和相关通路重要靶点可作为潜在治疗方法
乳酸杆菌缺乏的阴道菌群环境可能导致不良妊娠结局，补充益生菌可以起到置换和杀死病原体并调节免疫反应的作用。一些非孕期研究表明益生菌可以定植阴道，起到恢复微生物群的作用，并且可以减少泌尿生殖器感染的发生风险［63］。而对于口服益生菌对孕期阴道微生物组成及妊娠结局的影响，不同研究结果不一致。有研究发现，早孕期口服鼠李糖乳杆菌GR-1和罗伊乳杆菌RC-14的益生菌口服胶囊并未改变孕期阴道微生物菌群的多样性及组成［64-65］。但近期一项前瞻性研究发现，对于早孕期阴道内缺乏乳酸杆菌的孕妇，阴道补充鼠李糖干酪乳杆菌可能降低早产率［66］。
其他参与微生物宿主反应的因素也可以作为潜在的治疗方法。Sakai等［67］发现对宫颈黏液中IL-8浓度升高的孕妇进行阴道灌洗（聚维酮碘）及氯霉素阴道片治疗可降低早产率和早产胎膜早破发生率。此外，前述在C5aR缺陷小鼠中，脂多糖未成功诱导早产，说明C5aR可作为抑制早产的潜在靶点［40］。
因此，口服益生菌或针对宿主反应相关靶点进行治疗有可能减少早产的发生，但鉴于相关研究样本量较小及结果不完全一致，需开展样本量更大的随机对照研究证实。
五、结论及展望
综上，宫颈提前重构是早产的关键事件，阴道微生物菌群失调是高危因素之一。阴道微生物菌群失调导致宫颈提前重构的主要机制为上皮屏障被破坏，可能通过炎症、细胞坏死、EMT及上调miRNA等途径，未来仍需更多研究来挖掘其中的关键分子及调控通路。最终宫颈提前重构及早产是否发生取决于菌群与宿主的相互作用，宿主免疫状态及补体可能是这一过程的重要调节因素。代谢组学分析及初步体外细胞实验提示脂质代谢相关产物也可能参与此过程的调节，未来仍需研究来证明代谢物对菌群-宿主相互作用的重要性及内在机制。
对于短宫颈或宫颈扩张的预防及治疗方面，目前临床上一般在监测到上述宫颈提前成熟的表现时才会完善分泌物相关检测。虽此时宫颈结构已经改变而可能难以逆转，但或可以起到延缓成熟进程的作用，减少不良结局发生。提示分泌物检测孕周可提前，在宫颈结构急剧变化前进行治疗。另一方面，需识别短宫颈的其他病因，如宫颈机能不全、基因遗传、宫颈锥切、多囊卵巢综合征等［3］，未来也需要进一步探索。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
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