中华医学会
地址： 中国北京东四西大街42号
邮编： 100710
摘要
目的
探讨缺氧诱导因子1α（hypoxia induced factor-1α，HIF-1α）通过丙酮酸脱氢酶激酶1（pyruvate dehydrogenase kinase 1，PDK1）调控缺氧诱导的新生大鼠肺动脉内皮细胞（pulmonary artery endothelial cells，PAECs）增殖的作用机制。
方法
使用36只体重20~30 g、日龄7~10 d 的Wistar新生大鼠，对其PAECs进行分离、培养后，将体外培养的PAECs随机分为常氧组、缺氧组、HIF-1α+常氧组、HIF-1α+缺氧组、HIF-1α抑制剂（2-ME）+缺氧组、PDK1抑制剂+缺氧组。HIF-1α+常氧组和HIF-1α+缺氧组以腺病毒转染HIF-1α。于24 h、48 h和72 h，应用CCK8检测PAECs增殖能力，伤口愈合实验检测PAECs迁移率，实时荧光定量聚合酶链式反应及Western blotting实验检测PAECs中HIF-1α和PDK1的mRNA及蛋白表达水平，相应试剂盒检测PAECs葡萄糖摄取量及乳酸生成量。
结果
24 h、48 h及72 h，缺氧组和HIF-1α+常氧组PAECs增殖及迁移能力、HIF-1α和PDK1蛋白及mRNA表达水平、乳酸生成及葡萄糖摄入量高于常氧组，HIF-1α+缺氧组PAECs增殖及迁移能力、HIF-1α和PDK1蛋白及mRNA表达水平、乳酸生成及葡萄糖摄入量高于其他缺氧组，PDK1抑制剂+缺氧组和2-ME+缺氧组PAECs增殖及迁移能力、HIF-1α和PDK1蛋白及mRNA表达水平、乳酸生成及葡萄糖摄取量低于缺氧组，差异均有统计学意义（ P<0.05）。
结论
缺氧条件下，HIF-1α可能通过上调PDK1的表达增强Warburg效应，促进新生大鼠PAECs的增殖。
新生儿缺氧性肺动脉高压（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）是新生儿重症监护室常见的急危重症 ［ 1 , 2 ］ ，尚无有效治疗方法。其病理特征为肺血管阻力和血管重塑的不断升级，发病机制尚未明确 ［ 3 ］ 。肺动脉内皮细胞（pulmonary artery endothelial cells，PAECs）在血管重塑过程中起重要作用 ［ 4 , 5 , 6 ］ 。PAECs增殖机制中存在糖代谢通路异常 ［ 7 ］ ，在氧气充足的情况下以高糖吸收、有氧糖酵解及高乳酸生成为主，即Warburg效应 ［ 8 ］ ，丙酮酸脱氢酶激酶1（pyruvate dehydrogenase kinase 1，PDK1）是通过磷酸化负调节丙酮酸脱氢酶复合物（pyruvate dehydrogenase complex，PDC）活性的关键酶，而PDC失活与Warburg效应紧密相关 ［ 9 ］ ，并且PDK1可能参与缺氧期间内皮细胞增殖和凋亡的调节 ［ 10 ］ 。 在缺氧条件下，缺氧诱导因子1α（hypoxia induced factor-1 alpha，HIF-1α）与缺氧反应元件（hypoxia response elements，HRE）结合激活缺氧介导反应，转录并活化下游靶基因调控糖酵解的PDK1 ［ 11 , 12 , 13 ］ ，HIF-1α还可调控下游靶基因引起肺血管痉挛及重塑，造成新生大鼠肺动脉高压 ［ 14 ］ ，但HIF-1α是否通过PDK1影响Warburg效应参与HPH肺血管重塑过程尚未知晓。本研究旨在探讨HIF-1α是否促进PDK1表达增强Warburg效应，从而导致缺氧PAECs过度增殖，为气道重塑机制提供新的见解，并为HPH的治疗和潜在药物靶点提供实验依据。 材料和方法 一、实验动物及主要材料 1.实验动物：选择体重20~30 g、日龄7~10 d的Wistar新生大鼠36只，雌雄比例1∶1，购自新疆医科大学动物实验中心，动物许可证号：SCXK（新）2011-0004。所有动物均饲养于25℃、55%湿度、12 h明暗交替环境，保证充足的食物和水。本实验已通过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会审批（K202409-13）。 2.主要试剂与仪器：便携式细胞低氧培养箱（美国billups-rothenberg公司）、CY-100B氧浓度控制仪（上海玉研科学仪器有限公司）；超净工作台（上海精密仪器仪表有限公司）；解剖显微镜（南京雷炯仪器设备有限公司）、BX41TF光学显微镜（日本奥林巴斯）、相差显微镜（中科美菱低温科技有限责任公司）；HIF-1α腺病毒（上海GeneChem）、HIF-1α特异性转录抑制剂2-ME（广州威佳科技有限公司）、PDK1特异性抑制剂（美国APE x BIO）、乳酸和葡萄糖检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）。 二、实验方法 1.原代PAECs分离：所有Wistar新生大鼠断颈处死，75%酒精浸泡后取出肺动脉，将动脉内膜面贴入培养皿中并加入消化液，恒温培养箱中孵育后，用显微镊刮取肺动脉内膜面，吹打消化液并收集，细胞筛过滤后离心、弃上清，保留细胞沉淀。 2.原代PAECs鉴定：将细胞爬片放入24孔板中，注入内皮细胞完全培养基，放入37℃、5%CO 2恒温培养箱中培养贴壁后进行固定，室温通透、封闭，CD31（PAECs的特异性指标）孵育过夜，荧光（Cy3）标记羊抗小鼠IGg后湿盒孵育，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（代表活细胞核）避光孵育，封片后荧光显微镜下观察并采集图片。 3.原代PAECs培养：内皮细胞完全培养基重悬细胞后接种于培养皿中，37℃、5%CO 2恒温培养箱中静置培养，48 h后更换新鲜培养基，以后3 d换液一次，细胞长满后使用。 4.实验分组及缺氧PAECs模型建立：将PAECs按照单纯随机分组方法分为常氧组、缺氧组、HIF-1α+常氧组（HIF-1α腺病毒转染并常氧培养）、HIF-1α+缺氧组（HIF-1α腺病毒转染并缺氧培养）、2-ME+缺氧组（HIF-1α抑制剂干预并缺氧培养）、PDK1抑制剂+缺氧组（PDK1抑制剂干预并缺氧培养）。以上各组根据观察时间点另分为24 h、48 h和72 h亚组。常氧组细胞于37℃、5%CO 2恒温培养箱中培养，缺氧组细胞移至缺氧小室内，灌注由3%O 2、5%CO 2、92%N 2组成的混合气体后密封，置于37℃恒温培养箱中培养。 5.HIF-1α腺病毒转染：将生长状态良好的细胞制备成细胞悬液接种于6孔板内，待细胞融合至60%，吸弃培养液，加入含有HIF-1α的腺病毒（标有绿色荧光蛋白并携带HIF-1α基因的腺病毒载体）、病毒增强液、完全培养基的混合液（腺病毒滴度为1×10 10，最适感染复数值为100，病毒和增强液按照1∶1比例进行转染），8~12 h后更换为完全培养基。于转染24 h、48 h及72 h后在倒置荧光显微镜下观察腺病毒转染情况。 6.HIF-1α及PDK1抑制：HIF-1α抑制剂2-ME和PDK1抑制剂均以粉末形态存在，能在蛋白水平上抑制这两种物质的表达，使用二甲基亚砜作为溶剂。对目标细胞进行饥饿同步化处理后，再用培养基孵育12 h，随后将溶解好2-ME和PDK1抑制剂的二甲基亚砜溶液与完全培养基混合，用于细胞培养。在24 h、48 h、72 h对处理过的细胞进行后续实验操作。 7.CCK8实验检测细胞活性与增殖：用CCK8法检测PAECs活性与增殖，波长450 nm处的光密度值与细胞数量呈正相关。生长状态良好的PAECs以每孔细胞数5 000接种于96孔板中，根据分组干预处理后继续培养，于各检测时间将培养液更换为100 μl的新鲜完全培养基，并加入10 μl CCK8试剂，避光置于培养箱内孵育2 h后使用分光光度计测定光密度值。 8.伤口愈合实验测定细胞迁移：将生长状态良好的PAECs接种至6孔板中，密度达80%~90%时进行纵向划痕，洗去漂浮细胞后加入低血清培养基并进行干预处理。于划痕0 h、24 h、48 h和72 h选取同一视野使用显微镜采集图片，使用Image-Pro plus6.0软件测量划痕面积。迁移率计算公式：迁移率=（0 h划痕面积-该时间点划痕面积）/0 h划痕面积。 9.实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测PAECs中目的基因mRNA表达情况：弃去培养瓶内培养液，加入Buffer cRLQ消化裂解细胞，Trizol法提取RNA，分光光度计检测RNA浓度及纯度，冰上配置10 μl逆转录反应体系。上下游引物由上海生物工程合成有限公司合成，结果通过2-ΔΔCt法分析并计算。引物序列见 表1 。 10.Western Blotting实验检测PAECs内目的基因蛋白表达情况：弃去培养瓶内培养液，加入RIPA裂解液，提取总蛋白后，蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，封闭后分别加入HIF-1α（1∶1 000）、PDK1（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）抗体，4℃孵育过夜，加入二抗（1∶1 000），室温孵育2 h，加入增强型化学发光试剂显影，采用ImageJ对条带进行灰度值分析。 11.乳酸含量检测：PAECs用胰蛋白酶消化重悬后以10 5个/孔接种于6孔板内，各组干预处理后继续培养，不更换培养基，于24 h、48 h、72 h收集细胞培养基上清液，按照说明加入提取液，离心取上清，与标准品分别加入各反应液后37℃避光反应20 min，离心后取沉淀，乙醇充分溶解后在酶标仪570 nm处测定吸光值，根据标准品绘制出的标准曲线和对应公式计算乳酸含量。 12.葡萄糖含量检测：PAECs用胰蛋白酶消化重悬后以10 5个/孔接种于6孔板内，各组干预处理后继续培养，不更换培养基，于24 h、48 h、72 h收集细胞培养基上清液，按照说明于1.5 ml EP管中加入各反应试剂，涡旋混匀，100℃煮沸15 min，冷却至室温后，取200 μl至96孔板中测定630 nm处吸光值，按照对应公式计算葡萄糖含量。 三、统计学方法 应用SPSS 26.0统计软件对数据进行分析，应用Graphpad Prism 8.0进行制图。计量资料均进行Shapiro-Wilk正态性检验，符合正态分布的计量资料以均值±标准差表示，固定时间因素，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较采用LSD检验。 P<0.05为差异有统计学意义。 结 果 一、PAECs细胞鉴定情况 PAECs阳性率>90%，即细胞纯度>90%，见 图1 。 二、各组PAECs活性与增殖能力 24 h、48 h、72 h各组PAECs活性与增殖能力比较，缺氧组和HIF-1α+常氧组高于常氧组，HIF-1α+缺氧组高于缺氧组、2-ME+缺氧组及PDK1抑制剂+缺氧组，2-ME+缺氧组和PDK1抑制剂+缺氧组低于缺氧组，差异均有统计学意义（ P<0.05）。见 表2 。 三、各组PAECs迁移率 24 h、48 h、72 h各组迁移率比较，缺氧组和HIF-1α+常氧组高于常氧组，HIF-1α+缺氧组高于缺氧组、2-ME+缺氧组、PDK1抑制剂+缺氧组，2-ME+缺氧组和PDK1抑制剂+缺氧组低于缺氧组，差异均有统计学意义（ P<0.05）。见 图2 。 四、各组大鼠PAECs中HIF-1α和PDK1 mRNA表达水平 24 h、48 h、72 h各组HIF-1α及PDK1 mRNA表达水平比较，缺氧组和HIF-1α+常氧组高于常氧组，HIF-1α+缺氧组高于缺氧组、2-ME+缺氧组、PDK1抑制剂+缺氧组，2-ME+缺氧组和PDK1抑制剂+缺氧组低于缺氧组，差异均有统计学意义（ P<0.05）。见 表3 。 五、各组大鼠PAECs中HIF-1α和PDK1蛋白表达水平 24 h、48 h、72 h各组HIF-1α和PDK1蛋白表达水平比较，缺氧组和HIF-1α+常氧组高于常氧组，HIF-1α+缺氧组高于缺氧组、2-ME+缺氧组、PDK1抑制剂+缺氧组，2-ME+缺氧组和PDK1抑制剂+缺氧组低于缺氧组，差异均有统计学意义（ P<0.05）。见 图3 。 六、各组大鼠PAECs乳酸及葡萄糖含量 24 h、48 h、72 h各组乳酸及葡萄糖含量比较，缺氧组和HIF-1α+常氧组高于常氧组，HIF-1α+缺氧组高于缺氧组、2-ME+缺氧组、PDK1抑制剂+缺氧组，2-ME+缺氧组和PDK1抑制剂+缺氧组低于缺氧组，差异均有统计学意义（ P<0.05）。见 图4 、 5 。 讨 论 新生儿HPH是由血管收缩和肺血管重塑引起的肺动脉压升高以及右心室肥厚 ［ 15 ］ ，致死率高，确切机制尚未完全明了 ［ 16 ］ 。肺血管重塑为HPH的重要特征，涉及PAECs及肺动脉平滑肌细胞的增殖和迁移失调，其中内皮功能异常在介导肺血管系统结构变化中起至关重要的作用 ［ 17 ］ ，在肺动脉高压早期通过改善PAECs功能障碍促进血管重塑为目前研究的关注点 ［ 18 , 19 ］ 。而PAECs增殖严重依赖糖酵解 ［ 20 ］ ，研究显示，成人肺动脉高压和右心室衰竭患者PDK1表达增加 ［ 21 ］ ，沉默PDK1可抑制缺氧诱导的肺动脉高压 ［ 22 ］ 。本研究结果显示，在各观察时间点，缺氧组的PAECs增殖能力、迁移率、乳酸及葡萄糖含量均高于常氧组，且PDK1蛋白及mRNA表达水平高于常氧组。PDK1抑制剂+缺氧组PAECs的增殖及迁移能力、PDK1蛋白及mRNA表达量、乳酸和葡萄糖含量低于缺氧组。说明缺氧环境促进PAECs PDK1表达，增强PAECs的Warburg效应，刺激其增殖和迁移，使用PDK1特异性转录抑制剂后，PAECs的Warburg效应随之减弱，细胞增殖和迁移能力受抑制，提示缺氧对PAECs异常增殖的作用机制与PDK1激活及Warburg效应活跃有关。 HIF-1α是细胞适应缺氧的关键调节因子，缺氧条件下HIF-1α被激活并促进一系列表达变化，包括参与细胞代谢、血管生成、细胞增殖 ［ 23 ］ 。临床研究显示，HPH新生儿肺动脉收缩压水平与血清HIF-1α水平成正相关 ［ 24 ］ ，HIF-1α表达上调可启动HPH的血管重塑 ［ 25 ］ ，并且参与肺血管重塑过程中PAECs的过度增殖和抗凋亡 ［ 26 ］ 。本课题组前期研究也发现HPH新生大鼠HIF-1α水平升高 ［ 27 , 28 ］ ，HIF-1α与PDK1可能与HPH的发展有关。为验证HIF-1α与PDK1在HPH中的作用机制，本研究通过转染含有HIF-1α的腺病毒载体实现胞内HIF-1α过表达，并观察到标记腺病毒的绿色荧光，表明转染成功。 本研究结果显示，缺氧组和HIF-1α+常氧组PAECs的HIF-1α蛋白及mRNA表达均较常氧组明显升高，HIF-1α+缺氧组较缺氧组明显升高；PAECs增殖和迁移能力结果显示，缺氧组和HIF-1α+缺氧组高于缺氧组，HIF-1α+常氧组高于常氧组，其中HIF-1α+缺氧组最高，提示缺氧促进PAECs中HIF-1α表达，外源性HIF-1或内源性HIF-1α升高都能促进PAECs增殖和迁移，并且外源性HIF-1α会引起内源性HIF-1α表达增高，外源性HIF-1α转染成功的PAECs HIF-1α表达高于单纯缺氧。本研究结果还显示，HIF-1α+常氧组和HIF-1α+缺氧组PAECs的PDK1蛋白及mRNA表达量、乳酸及葡萄糖含量均高于常氧组和缺氧组，提示HIF-1α过表达可促进PDK1表达水平升高，增强PAECs的Warburg效应，促进增殖及迁移，这与Luo等 ［ 29 ］ 在胰腺癌小鼠模型中得出的结论相吻合。本研究在常氧条件下对PAECs进行HIF-1α外源性转染增强了PAECs的Warburg效应，与Chen等 ［ 30 ］ 的研究结果一致，同时，本研究发现PDK1表达水平上调，这与对PAECs进行单纯缺氧干预得出的结果一致，而2-ME可显著抑制这种变化，证明了缺氧PAECs异常增殖的作用机制可能为HIF-1α直接或间接对PDK1进行调控并影响Warburg效应。本研究应用HIF-1α特异性转录抑制剂2-ME后，2-ME+缺氧组各时间点HIF-1α及PDK1蛋白及mRNA表达水平均显著下降，Warburg效应减弱，缺氧诱导的细胞增殖和迁移得到有效抑制。因此，HIF-1α可通过调控PDK1影响Warburg效应，从而在PAECs增殖过程中起作用。而抑制HIF-1α表达可减少缺氧PAECs的PDK1表达水平，进而抑制其Warburg效应，对抗缺氧诱导的PAECs增殖。 目前临床上针对新生儿HPH的治疗大都局限于改善缺氧早期的肺血管痉挛，包括一氧化氮吸入、应用西地那非、米力农以及前列环素等 ［ 31 ］ ，一旦涉及到血管重塑阶段，则疗效欠佳。本研究结果显示，抑制HIF-1α或PDK1能够显著减弱缺氧环境下PAECs的Warburg效应，有效抑制PAECs增殖。因此，使用针对HIF-1α和PDK1的抑制剂可能减缓HPH气道重塑的病理进程，成为治疗新生儿HPH的重要手段，进一步探索HIF-1α和PDK1的上下游调控机制可以为临床治疗提供更为精准的靶向药物。此外，考虑到新生儿的特殊生理状态，开发的药物需要具有良好的耐受性和最小不良反应，以确保在不影响正常生理功能的前提下，有效控制HPH的进展。这些抑制剂在不同阶段HPH中的应用效果以及与其他治疗手段的联合应用也值得关注。 综上所述，本研究通过从细胞水平构建新生大鼠PAECs缺氧模型，发现对缺氧新生大鼠PAECs外源性转染HIF-1α可上调PDK1表达，增强缺氧新生大鼠PAECs的Warburg效应，促进其增殖和迁移，初步阐明了HIF-1α可能通过调节PDK1影响Warburg效应，参与了PAECs增殖的过程，为针对HPH气道重塑的治疗靶点提供了参考。但本研究也存在一些局限性，观察时间跨度较短，未分析缺氧程度的影响，HIF-1α与PDK1之间的具体上下游调控关系尚未完全明晰，后续仍需进一步研究，同时还应结合在体实验深入研究HIF-1α与PDK1的上下游调控机制，为临床治疗提供更精确的理论依据。 引用本文:罗洋,王乐,李珊珊,等. 缺氧诱导因子1α调控缺氧诱导的新生大鼠肺动脉内皮细胞增殖机制研究[J]. 中华新生儿科杂志（中英文）,2025,40(04)：226-233.DOI:10.3760/cma.j.cn101451-20240914-00326.
