摘要

目的　再评价意义未明（variants of uncertain significance， VUS）染色体微缺失微重复拷贝数变异（copy number variant， CNV）的致病性。  

方法　本研究为回顾性研究。2018年1月1日至2022年12月31日，1 882例孕妇在解放军总医院第一医学中心通过介入性产前诊断方法进行了染色体微阵列分析。按照美国医学遗传学与基因组学学会指南对检测结果进行致病性评级，以评级为VUS的82例胎儿作为研究对象。分析介入产前诊断指征，并随访胎儿期超声情况、亲本来源鉴定结果和妊娠结局等，并结合最新的研究和报道对VUS CNV重新评级。对数据采用描述性统计分析。  

结果　（1）82例VUS CNV胎儿中，产前诊断指征为超声提示胎儿结构异常、胎儿游离DNA异常、血清学筛查高风险、孕妇高龄（预产期≥35岁）和其他指征者分别为21例（25.6%）、12例（14.6%）、7例（8.5%）、28例（34.1%）和14例（17.1%）；16例（19.5%）伴有异常表型，其中7例因产前诊断超声胎儿伴有严重结构异常而终止妊娠。75例活产儿随访了25（13～66）月。（2）82例中，5例胎儿各检出2段VUS CNV，其余77例均仅检出1段，共检出87段VUS CNV。87段CNV中，染色体微重复63段（72.4%），染色体微缺失24段（27.6%）。CNV片段大小为0.85（0.05～5.61） Mb，其中82段CNV片段大小<2 Mb。44例（53.7%）拒绝行亲本来源鉴定，其余38例（46.3%）行亲本来源鉴定，结果其中8例（21.0%）为新发变异，30例（78.9%）分别遗传自父亲或母亲（母源12例、父源18例）。（3）87段VUS CNV中，11段（12.6%）CNV评级发生改变，包括1段4p16.2微缺失和2段15q11.2微缺失升级为致病性，1段16p13.11微重复升级为可能致病性，1段Xp22.31微重复和2段2q13微缺失降级为可能良性，以及4段Xp22.31微重复降级为良性。（4）伴有异常表型的16例胎儿中，7例产前出现异常表型者均引产终止妊娠，包括6例胎儿结构异常，以及1例严重胎儿生长受限；再评价后1例升级为致病性，6例仍为VUS。活产且生后出现异常表型的9例再评价后评级均未发生变化。不伴有异常表型的66例（80.5%）中，10例再评价后评级发生变化。  

结论　VUS CNV胎儿多无明显异常表型，预后相对较好，但需要进一步随访。行亲本来源鉴定能够更好地为遗传咨询提供参考。

【关键词】  染色体微缺失微重复；意义未明变异；产前诊断；遗传咨询

一、研究对象

本研究为回顾性研究。2018年1月至2022年12月，在本单位就诊的共1 882例孕妇通过介入性产前诊断方法（样本包括羊水1 872例、脐带血9例和绒毛1例）进行了CMA。介入性产前诊断指征主要包括胎儿超声异常（结构异常及软指标异常）、血清学筛查高风险、胎儿游离DNA无创产前检测（non-invasive prenatal testing， NIPT）异常、孕妇高龄（预产期年龄≥35岁）及其他（胎儿父母染色体结构变异或不良妊娠史等）。临床上建议行介入性产前诊断的指征优先级依次为超声结构异常、胎儿游离DNA NIPT异常、血清学筛查高风险、软指标异常、孕妇高龄和其他指征。统计产前诊断指征时，亦参照上述优先级。按照美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics， ACMG）指南对检测结果进行致病性评级，以其中CMA结果提示胎儿染色体存在1段或多段VUS CNV的82例胎儿为研究对象。

排除标准：（1）CMA结果提示胎儿同时存在致病性或可能致病性CNV；（2）同时存在致病性染色体数目或结构异常；（3）同时存在单亲二倍体；（4）失访者。本研究的纳入和排除流程见图1。

二、研究方法

1.CMA：采用Affymetrix平台的CytoScan 750k芯片扫描，检测流程包括消化、连接、聚合酶链反应（polymerase chain reaction， PCR）产物纯化、片段化处理，以及标记、探针杂交、洗染、扫描等过程。读取数据。检测工作由北京贝康医学检验所有限公司完成。

2.致病性分析及报告原则：采用GRCh37/hg19基因组版本。根据ACMG指南^［7］及相关数据库提供的证据，依次评估CNV基因组含量、是否与明确单倍剂量不足敏感（haploinsufficient， HI）/三倍剂量敏感（triplosensitivity， TS）区域重叠、基因个数、已发表文献、公共数据库和实验室内部数据，以及遗传方式，对CNV进行评分，并将CNV分为5级：致病性（≥0.99分）、可能致病性（0.90～0.98分）、VUS（－0.89～0.89分）、可能良性（－0.98～－0.90分）和良性（≤－0.99分）。如结果评级为VUS，遗传咨询时常规建议进行亲本来源鉴定。

检测结果只报告与疾病相关的CNV。原则上不报告<100 kb的缺失片段、<200 kb的重复片段，以及良性和可能良性CNV。对于小于100 kb的CNV，如果涉及与疾病相关的在线人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man， OMIM）基因，则在采用其他方法（如实时荧光定量PCR）验证之后报告。

3.观察指标和再评级：根据孕妇在本单位就诊的病历和检查结果，记录研究对象的产前诊断指征、采集样本类型、CMA检测结果、CNV片段大小、CNV涵盖的OMIM基因、胎儿超声检查情况，以及CNV亲本来源鉴定结果。电话随访妊娠结局和活产胎儿生后1～6年情况。2024年12月16日至12月20日，结合亲本来源鉴定结果及胎儿表型，查阅最新文献，并检索ClinGen、基因组变异数据库（Database of Genomic Variant， DGV）和gnomAD等数据库，对所有VUS CNV进行再评级。分析介入性产前诊断的指征，并随访胎儿期超声情况、亲本来源鉴定结果和胎儿出生后情况，并结合最新文献对VUS CNV重新评级。

三、统计学分析

采用Excel收集临床数据。计数资料以例数和百分数表示，计量资料以M（min~max）表示，进行描述性统计分析。

一、一般情况

82例VUS CNV胎儿中，21例（25.6%）产前诊断指征为超声提示胎儿结构异常，12例（14.6%）为胎儿游离DNA NIPT异常，7例（8.5%）为血清学筛查高风险，28例（34.1%）为孕妇高龄，其余14例（17.1%）为其他指征。见表1。82例中的16例（19.5%）伴有异常表型，其中7例因产前诊断超声发现胎儿伴有严重结构异常，家属担心生后预后不良或治疗费用昂贵而选择终止妊娠。活产儿共75例，随访中位年龄25（13～66）月。

二、VUS CNV的检出情况及来源

1.检出情况：82例中，有5例胎儿CMA各检出2段VUS CNV，其余77例均仅检出1段，共检出87段VUS CNV。87段CNV中，染色体微重复63段（72.4%），染色体微缺失24段（27.6%）。这些VUS CNV片段的大小为0.85（0.05～5.61） Mb，其中82段大小<2 Mb。

2.CNV来源：82例中的44例（53.7%）拒绝行亲本来源鉴定，其余38例（46.3%）行亲本来源鉴定，结果其中8例（21.0%）为新发变异，30例（78.9%）分别遗传自父亲或母亲（母源12例，父源18例）。

三、不同类型VUS CNV胎儿的预后、随访情况及致病性再评价

（一）伴有异常表型的病例

1.引产终止妊娠病例：共7例（8.5%，7/82）。7例中，6例为胎儿结构异常，包括胎儿小脑蚓部未显示、唇腭裂、膈疝、胎儿完全性大动脉转位、胎儿右肾多囊性发育不良和法洛四联症各1例；1例为严重胎儿生长受限。见表2。表2例5为4p16.2微缺失胎儿，该CNV涉及的MSX1基因在产前诊断后3个月被明确为单倍剂量不足基因，赋分1分，其余部分分数无增减，再评价升级为致病性。

其余6例CNV分析胎儿表型与所检出的CNV所涉及基因报道表型不一致，考虑表型与CNV关系不明确，再评价仍为VUS。

2.活产且生后有异常表型：共9例（11.0%），表型包括白血病、语言发育迟缓、卵巢囊肿、房间隔缺损、胆道闭锁、右上臂静脉曲张（3岁出现，1个月后自然消退）、右足内翻、脐膨出、胎儿心血管畸形各1例。这些表型均与所检出的CNV所涉及基因报道表型不一致，考虑表型与CNV关系不明确，再评价后评级均未发生变化。见表3。

1例13q32.3q33.1微重复（表3例2）涉及NALCN基因，其杂合性变异与常染色体显性遗传的先天性肢体和面部挛缩伴肌张力低下和发育迟缓等疾病相关，临床表型包括肌张力减退、发育迟缓、语言发育迟缓、癫痫发作和小脑萎缩等，与本研究中患儿语言发育迟缓的表型有交叉，但其剂量敏感性的证据尚不明确。

2例10q21.3微缺失（表2例7和表3例9）均涉及CTNNA3基因，该变异可表现为心室结构和功能异常。表3例9患儿的10q21.3微缺失遗传自胎儿母亲，CMA结果回报后，嘱胎儿母亲完善24 h动态心电图结果提示房性早搏、室性早搏和短阵房性心动过速，但超声心动图未见明显异常。然而本研究中的10q21.3微缺失只涉及CTNNA3基因的第11号外显子区和第8～9号外显子区，目前缺乏更多证据表明2例患儿及患儿母亲异常表型与CNV相关。

通过数据库检索CNV覆盖基因，并查阅文献，该9例均考虑与微缺失/重复关系不明确，在专科治疗或保守观察中，CNV再评价未改变评级。

（二）不伴有异常表型的病例

共66例（80.5%），其中10例的评级发生变化。

1.2q13微缺失病例：共2例，为双绒毛膜双羊膜囊双胎，缺失区域均为2号染色体11 049 142～110 980 295。该区域在DGV和gnomAD数据库有大于该片段缺失的病例收录，人群频率0.57%，赋分－0.90分；其父母未行亲本来源鉴定，其他部分不得分。故再评价降级为可能良性。

2.15q11.2微缺失病例：共2例，为双绒毛膜双羊膜囊双胎，未行亲本来源鉴定，随访时2岁10个月，均未见明显异常表型，缺失区域分别为15号染色体22 770 422～23 282 798和22 770 422～23 282 788，包含15q11.2复发性区域（BP1-BP2），为神经易感区域。根据我国2023年发布的CMA应用指南^［5］认为其外显率为10.4%（8.5%～12.7%），归类为致病性。

3.16p13.11微重复病例：1例，未行亲本来源鉴定。随访时3岁7个月，未见明显异常表型，其重复区域为16号染色体15 058 820～16 282 869，与16p13.11复发性区域（BP2-BP3）重叠98.8%。该区域也为神经易感区域，我国CMA应用指南认为其外显率为8.4%，建议评级为可能致病性^［5］。此外，该例胎儿亦携带2p14p13.3微重复，重新评分后为0分，评级仍为VUS。

4.Xp22.31微重复病例：共8例，见表4。其中例2～5的CNV区域大于明确良性的CNV，且不包含其他蛋白质编码基因，赋分－0.90分；CNV遗传自无异常表型的父亲或母亲，且无家族史，赋分－0.15分；故总分为－1.05分，降级为良性。例7的CNV区域大于明确的良性CNV，且不包含其他蛋白质编码基因，赋分－0.90分；该例未行亲本来源鉴定。故总分为－0.90分，降级为可能良性。余4例再评价仍为VUS。

5.其余53例：再评价后仍为VUS。

四、VUS的评级变化

87段VUS CNV中，11段（12.6%）CNV经过再评价后评级发生改变，包括1段4p16.2微缺失和2段15q11.2微缺失升级为致病性，1段16p13.11微重复升级为可能致病性，1段Xp22.31微重复和2段2q13微缺失降级为可能良性，以及4段Xp22.31微重复降级为良性。

一、亲本来源鉴定可为致病性判断、遗传咨询提供参考

本研究38例行亲本来源鉴定的家庭中，78.9%（30/38）VUS CNV遗传自父亲或母亲。VUS CNV多遗传自父母一方，少部分VUS CNV为新发变异。Shi等^［10］收集139例VUS CNV胎儿，其中108例（77.7%）遗传自父母一方。大部分的VUS CNV是家族特异性的，因此基于亲本验证的遗传咨询会更加清晰^［11］。若CNV遗传自无异常表型的父母，则根据CNV评分标准可相应减分，一些VUS可因此降级。但需要注意的是，即使父母无异常表型，遗传给胎儿仍有可能出现疾病表型，这可能与外显率差异、遗传调控或环境因素相关^［12］。对于新发变异和未行亲本来源鉴定者，仅能根据患者表型与临床报道表型对比，给出相应得分，提供临床建议。

二、对评级改变病例的分析

多项研究认为VUS CNV倾向于良性变异。Chen等^［9］的研究收集了1 689 845例0~89岁不同种族人口样本，对其中37 699例VUS进行再评价，结果共有30 239例（80.2%）被重新归类为良性或可能良性，由此认为人口数据对VUS降级的作用比升级更明显。Burke等^［13］系统回顾了VUS的相关问题，认为只有少数VUS在重新评估后升级为致病性。本研究中有11段CNV再评价后改变了分级，包括3段升级为致病性，1段升级为可能致病性，4段降级为良性，3段降级为可能良性。

1.升级（包括致病性和可能致病性）的病例：1例4p16.2微缺失病例涉及的MSX1与常染色体显性遗传的牙齿发育不全相关，并可伴指甲发育不良和/或口面裂^［14］。但由于该病例因产前超声提示完全性大动脉转位孕期引产，引产儿的外观（包括颌面部）未见明显异常，未能随访到与MSX1单倍剂量不足相关的症状。该胎儿母亲行介入性产前诊断后3个月，MSX1被证明为单倍剂量不足基因。这一情况提示，数据库更新速度快，需要定期查阅数据库、文献，结合病例对CNV进行再评价。另2段升级为致病性的15q11.2微缺失病例和1段升级为可能致病性的16p13.11微重复病例，随访时均未见明显异常表型，缺失/重复区域均涉及了神经易感区域，具有不完全外显率，存在较大的表现度差异^［5］，因此未来需要定期随访神经系统症状。

2.降级为可能良性和良性的病例：共7例，随访均未出现明显异常表型，其降级为可能良性或良性的依据均为其拷贝数改变的区域被证明为良性，或在正常人群中达到一定比例。这提示，对于没有明显异常表型的VUS CNV患儿，可将其病例资料及时上传数据库，实现数据共享，为正常人群CNV数据提供数据支持。

三、对未改变评级病例的分析

对活产儿的随访显示，新生儿出现异常表型较少，绝大多数均未见明显异常，但不能完全排除这些携带VUS CNV的婴幼儿是否存在晚发型表型，可能需要更长时间的随访，并关注数据库的更新。出现异常表型的活产儿中，如13q32.3q33.1微重复涉及NALCN基因的病例，其杂合性变异可出现与本研究中患儿相符的语言发育迟缓，但查阅数据库发现，NALCN基因没有明确的剂量敏感性证据，语言发育迟缓这一表型也不具有特异性，且该患儿CNV遗传自无异常表型的父亲，因此无法判断该CNV的致病性。

本研究中2例10q21.3微缺失均位于CTNNA3基因内部。OMIM数据库显示，CTNNA3基因在心肌内层闰盘中高表达^［15］，其变异与常染色体显性遗传的家族性心律失常性右心室发育不良13型相关，表现为心室结构和功能异常、心电图去极化/复极化改变、折返性心律失常和猝死^［16］，但该2例患儿的表型与文献报道不相符，需要更多的实验及病例对该基因变异的致病性提供更多证据。

本研究有7例胎儿因产前超声发现严重结构异常，家属担心生后预后不良或治疗费用昂贵而选择引产，表型均与VUS关系不明确，对于胎儿结构异常的除了考虑CNV外，亦需要考虑表型与单基因病的关系，必要时需要加做全外显子组或全基因组检测。

四、本研究意义及局限性

国内外多项研究指出了随访VUS CNV的重要性^{［11，17-19］}。本研究评估并随访了82例CNV首次被分级为VUS的胎儿，并对活产儿追踪至出生后1～6岁，为临床咨询提供了真实案例。本研究根据CNV评分系统，利用最新的文献报道及数据对所有CNV进行重新评分，最终改变了11段CNV评级。但本研究的不足之处在于样本量不够大，亲本来源鉴定数量有限。本研究报道的超声结构异常，如唇腭裂、法洛四联症等临床上考虑与单基因病关系不大，故除CMA外未行全外显子组测序等进一步检测。未来将积累更多的资料进行研究，持续更新VUS CNV的评级情况，为临床咨询提供参考。

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